胡萝卜片中富集植物乳杆菌的工艺优化

崔 莉，牛丽影，黄家鹏，李大婧，张钟元，刘春菊，刘春泉，刘莹萍，肖丽霞,*

胡萝卜片中富集植物乳杆菌的工艺优化

崔 莉1，牛丽影1，黄家鹏1，李大婧1，张钟元1，刘春菊1，刘春泉1，刘莹萍2，肖丽霞2,*

（1.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014；2.扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州 225127）

为将植物乳杆菌富集到胡萝卜中以制备含益生菌的果蔬功能食品，本研究首先通过单因素和正交试验优化植物乳杆菌以真空浸渍和超声浸渍的方式富集到胡萝卜片中的工艺参数，然后以常压浸渍为对照比较3 种浸渍方式下胡萝卜片中富集的活菌数，以期获得较优的胡萝卜植物乳杆菌富集方式。结果表明，真空浸渍较优工艺参数为真空浸渍温度35 ℃、真空浸渍时间15 min、复压浸渍时间20 min；超声浸渍较优工艺参数为超声浸渍温度30 ℃、超声浸渍功率125 W、超声浸渍时间12 min。比较真空浸渍、超声浸渍和常压浸渍3 种方式下胡萝卜中活菌数可知，真空浸渍组活菌数最多，达到1010CFU/g以上；扫描电子显微镜结果显示，在真空和超声浸渍的胡萝卜组织中均观察到杆状菌体，而在常压浸渍样品的组织内部未发现菌体。3 种浸渍方式下胡萝卜组织表面均有大量菌体。本研究获得了较优的胡萝卜中富集植物乳杆菌工艺参数，为乳酸菌或其他菌通过真空浸渍富集到果蔬组织中提供实验依据，也为含益生菌功能食品开发提供新思路。

益生菌；胡萝卜片；真空浸渍；超声浸渍

益生菌是指当摄入充足数量时，对宿主（人体）产生一种或多种经过论证的功能性健康益处的活微生物。乳酸菌是益生菌的一种，除了能改善胃肠道功能[1]外，还具有提高免疫力[2]、抗菌[3]、降胆固醇[4]、预防糖尿病[5]等功能。目前工业上的益生菌功能食品主要是乳制品，但其保质期有限，也不适合乳糖不耐症和乳制品过敏消费者[6]，这促使研究者不断开发新型益生菌产品，如含益生菌香肠[7]益生菌发酵果蔬汁[8]和富益生菌鲜切果蔬[9]、果蔬脆[10]等。Lapsley等[11]发现，当果蔬组织的间隙在21～35 nm之间时，可以将益生菌固定于果蔬细胞间隙中。胡萝卜营养丰富，价格低、产量大、耐储存，具有明目、护心、养颜、防癌等功能[12]，细胞体积为0.8×105～4.0×105μm3[13]，推测细胞间隙约为1～10 μm，是富集益生菌的理想原料。

在自然状态下，溶液中的离子或活性物质很难富集到食品内部，且耗时较长。为了缩短生产周期，提高效率，研究者不断尝试新的手段来加速富集过程，其中应用较广的为真空浸渍和超声浸渍。真空浸渍是以一种可控方式使悬浮物质直接进入到产品的多孔结构中，通过真空可以将食品细胞间隙中的气体和液体抽去，从而使其他物质如微生物、矿物质或其他生物活性物质进入到食品组织内[14]；超声浸渍[15]则是利用超声波的空穴作用击穿食品内细胞的细胞膜，从而使外部物质浸入到食品内部。本研究以胡萝卜片为富集益生菌的载体，分别采用真空浸渍及超声浸渍进行菌富集处理，以活菌数为指标在单因素试验的基础上通过正交试验设计优化富集工艺，再以常压浸渍为对照，比较较优条件下真空浸渍和超声浸渍的富集效果，获得适宜的益生菌富集方式，以期为胡萝卜片富集益生菌提供更优的条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

胡萝卜购于南京孝陵卫菜市场；蔗糖购于南京苏果超市；植物乳杆菌SICC 1.376购于四川省工业微生物菌种保藏管理中心，经本实验室检测其具有抗氧化及耐酸耐胆盐等益生功能。

MRS肉汤培养基 北京陆桥技术有限公司；琼脂南京奥多福尼生物科技有限公司；氯化钠 西陇化工股份有限公司。

1.2 仪器与设备

循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；超声波清洗机 昆山禾创超声仪器有限公司；SW-CJ-2D型净化工作台 苏州净化设备有限公司；高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械制造有限公司；BS224S电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；恒温恒湿箱 上海新苗医疗器械制造有限公司；TG16-WS台式高速离心机 湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司；HyG-A全温摇瓶柜 太仓实验设备厂；LGJ-12冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司；EVO-LS10扫描电子显微镜 德国蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 浸渍液制备

将4 ℃保藏的菌种活化2～3 代→转接于装有MRS液体培养基的三角瓶中→37 ℃扩大培养12 h→离心（4 800 r/min，10 min）→用10%蔗糖溶液稀释沉淀菌种制成浸渍液，备用。

1.3.2 植物乳杆菌的富集工艺

工艺流程：挑选材料→清洗→沥干→去皮→切片→烫漂→浸渍→沥干→干燥→包装。

操作要点：1）挑选材料：选取新鲜无机械损伤的胡萝卜；2）切片：将清洗去皮后的胡萝卜切成3～4 mm厚的薄片；3）烫漂：将胡萝卜片放入沸水中烫漂90 s，快速取出放入冷水中冷却；4）浸渍：真空浸渍和超声浸渍均是将胡萝卜片置于装有浸渍液的容器内，料液比为1∶2，保持液面没过胡萝卜片，分别进行浸渍富集处理。1.3.3 单因素试验设计

1.3.3.1 真空浸渍单因素试验设计

真空浸渍温度：真空浸渍时间15 min，复压浸渍时间10 min，保持真空压力0.09 MPa浸渍过程中的温度分别为25、30、35、40、45 ℃时，测定胡萝卜片中活菌数。真空浸渍时间：真空浸渍温度30 ℃，复压浸渍时间10 min，保持真空压力0.09 MPa抽真空时间分别为5、10、15、20、25 min时，测定胡萝卜片中活菌数。复压浸渍时间：真空浸渍时间15 min，真空浸渍温度30 ℃，抽真空结束，在常压下的浸渍时间分别为5、10、15、20、25 min时，测定胡萝卜片中活菌数。

1.3.3.2 超声浸渍单因素试验设计

超声浸渍温度：超声浸渍功率150 W，超声浸渍时间9 min，测定在超声浸渍温度25、30、35、40、45 ℃条件下胡萝卜片中活菌数。超声浸渍功率：超声浸渍时间9 min，超声浸渍温度30 ℃，测定在超声浸渍功率100、125、150、175、200 W条件下胡萝卜片中活菌数。超声浸渍时间：超声浸渍功率150 W，超声浸渍温度30 ℃，测定在超声浸渍时间3、6、9、12、15 min条件下胡萝卜片中活菌数。

1.3.4 正交试验设计

以单因素试验结果为依据，真空浸渍中以真空浸渍温度、真空浸渍时间、复压浸渍时间为试验因素，以活菌数为指标进行正交试验设计见表1；超声浸渍中以超声浸渍温度、超声浸渍功率、超声浸渍时间为试验因素，以活菌数为指标进行正交试验设计见表2。

表1 真空浸渍正交试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels used for orthogonal array design for optimization of vacuum impregnation parameters

1.3.5 常压浸渍

在常压环境40 ℃条件下，将胡萝卜片浸渍于浸渍液中1.5 h。

1.3.6 乳酸菌数测定

参照GB 4789.35—2010《食品微生物学检验 乳酸菌检验》方法[16]，将富集了益生菌的胡萝卜样品经真空冷冻干燥后打粉测定，活菌数单位为CFU/g干样。

1.3.7 植物乳杆菌附着情况的观察

采用扫描电子显微镜观察植物乳杆菌在胡萝卜表面和内部的附着情况[17]。

1.4 数据统计分析

用Microsoft Excel 2003进行数据整理，用Origin 8.6进行作图分析，采用SAS V8统计进行方差分析，并应用邓肯多重比较方法进行样品间的显著性差异分析。P＜0.05表示存在显著差异。每次实验做3次重复，取平均值，并计算标准偏差。

2 结果与分析

2.1 真空浸渍单因素试验结果

2.1.1 真空浸渍温度对胡萝卜中活菌数的影响

图1 真空浸渍温度对胡萝卜中活菌数的影响Fig. 1 Effect of vacuum impregnation temperature on the number of viable bacteria in carrot

真空浸渍技术是基于某些食品多孔结构能够在抽真空后被浸渍液占据的原理。影响真空浸渍效果的因素主要有注入浸渍液体积、物料浸渍体积变形率和有效空隙率。真空浸渍时间、压力、浸渍液组成成分、浸渍温度、浸渍液浓度等通过影响上述3 种参数，影响真空浸渍效果[18]。以浸渍后胡萝卜片中活菌数为指标，考察浸渍温度对浸渍效果的影响。如图1所示，随着温度从25 ℃升高到45 ℃，活菌数随呈现先增加后减少的趋势，35 ℃为拐点，活菌数为2.45×1010CFU/g。在25～35 ℃内，菌数随温度升高而增加，可能原因是温度升高致使液体黏度下降[19]，流动性增加，有利于含菌体的浸渍液渗入胡萝卜的组织间隙内，从而使浸渍液体积升高，进而提高浸渍效率。也可能由于温度升高促使胡萝卜软化，细胞孔隙增大，引起物料浸渍体积变形率和有效空隙率升高，提高了浸渍效率。在40～45 ℃时，观察到菌数下降可能是由于温度超出菌体的最适温度，引起蛋白质、DNA等生物大分子热变性，导致菌体失活，菌数下降[20]。故确定浸渍温度为35 ℃。

2.1.2 真空浸渍时间对胡萝卜中活菌数的影响

图2 真空浸渍时间对胡萝卜中活菌数的影响Fig. 2 Effect of vacuum impregnation time on the number of viable bacteria in carrot

如图2所示，植物乳杆菌数随抽真空时间的延长呈现先增加后稳定的趋势。抽真空可以将胡萝卜组织中的气体和占据组织间隙的汁液排出，当瞬时恢复大气压时菌液趁势吸入，进入到胡萝卜组织间隙中。真空浸渍的效率主要由浸渍液占据物料多孔间隙的效率决定。研究发现，浸渍时间显著影响物料中注入浸渍液体积和有效孔隙率[21-24]。结果显示，在抽真空5～15 min内，胡萝卜中活菌数随着抽真空时间延长而变大，但在15 min后活菌数并未继续增加而是略有下降。这与Krasaekoopt等[22]的研究结果相似，其在番石榴的真空浸渍益生菌过程中发现，随着抽真空时间5～15 min变化，浸渍液体积、有效孔隙率和活菌数均呈现先上升后下降的趋势。可能原因为，在抽真空初期，胡萝卜孔隙随着抽真空时间延长而变大，导致被排出的气体和汁液也增加，因此在恢复大气压时，被吸入浸渍液增加从而的检测到胡萝卜中活菌数增加。当达到临界点时，胡萝卜组织发生部分变形，无法继续包持浸渍液，从而出现略下降的趋势。

2.1.3 复压浸渍时间对胡萝卜中活菌数的影响

根据Fito[25]的理论，真空浸渍技术利用了由压差引起的水动力学机理和变松弛现象。水动力学机理是指由于食品细胞内的液体在真空、低温环境下容易汽化蒸发，会在物料内部形成了一些泡孔结构，在压力差和毛细管效应的共同作用下，浸渍液更容易渗入物料结构内部。同时，被浸渍的物料整体在真空条件下会产生一定的膨胀，导致细胞之间的间距增大，这被称作变形松弛现象，它也有利于浸渍液更快渗入到物料的内部。最终在水动力学和物料变形松弛现象的共同作用下，完成浸渍过程。真空浸渍分为2 个阶段，真空阶段和复压阶段。在真空阶段，食品组织内部的空气在水动力学机理和变松弛现象作用下膨胀并部分流出。在复压阶段，食品组织内部剩余的空气被压缩，浸渍液在外压作用下挤入物料孔隙中。同时，细胞之间的间隙虽然所占体积不多，但也可以容纳浸渍液。所以复压时间的研究非常重要，对浸渍效率有显著影响。

图3 复压浸渍时间对胡萝卜中活菌数的影响Fig. 3 Effect of restoration time on the number of viable bacteria in carrot

如图3所示，在5～10 min内，活菌数快速增加。在10～25 min内，活菌数保持相对稳定。此结果与Hironaka等[26]的研究一致，其在土豆中浸渍铁元素实验中发现，在0～3 h内土豆中的铁元素含量逐渐升高，在3～4 h达到稳定。此文献中浸渍时间较长主要是由于对整个土豆进行浸渍，其周皮组织不利于水和空气的渗透。Mujica-Paz等[27]采用13.5～67.4 kPa真空压力10 min，复压10 min，将蔗糖溶解浸渍入芒果、苹果和甜瓜切片中。Gras等[28]采用5 kPa真空压力10 min，复压10 min，将蔗糖和乳酸钙的等渗溶液浸渍入茄子、胡萝卜和平菇切片中。综上，确定复压浸渍时间为15 min。

2.2 真空浸渍参数正交试验结果

2.2.1 真空浸渍正交试验设计及结果

由表3可知，真空浸渍较优工艺参数为A2B2C3，即当真空浸渍温度35 ℃、真空浸渍时间15 min、复压浸渍时间20 min时真空浸渍的胡萝卜片中富集的植物乳杆菌最多。由表4可知，各因素对活菌数影响主次为真空浸渍温度＞真空浸渍时间＞复压浸渍时间。

表3 真空浸渍正交试验设计及试验结果Table 3 Orthogonal array design with experimental results for optimization of vacuum impregnation parameters

表4 真空浸渍正交试验设计方差分析Table 4 Analysis of variance of the orthogonal array design for optimization of vacuum impregnation parameters

2.2.2 验证实验

对正交试验优选出的真空浸渍最佳工艺参数进行验证实验，按照最佳工艺条件操作的胡萝卜片中的活菌数为10.16（lg（CFU/g）），高于表3中每一项试验结果，验证了所选取工艺条件的合理性。

2.3 超声浸渍单因素试验结果

2.3.1 超声浸渍温度对胡萝卜中活菌数的影响

图4 超声浸渍温度对胡萝卜中活菌数的影响Fig. 4 Effect of ultrasonic impregnation temperature on the number of viable bacteria in carrot

如图4所示，在一定范围内，随着超声浸渍温度的升高，液体分子运动加快造成浸渍液黏度变小，有利于植物乳杆菌进入到胡萝卜组织内部，温度继续升高，黏度趋于稳定，渗入的植物乳杆菌数也趋于稳定。温度为25 ℃时，富集的活菌数远低于其他温度，当浸渍温度为30 ℃时，胡萝卜中的活菌数已达到最多，比真空浸渍的最适温度35 ℃低，这可能是因为在超声时部分质点物质吸收超声波，使超声波的动能转化为热能，从而导致浸渍液的温度升高[26]。因此确定浸渍温度为30 ℃。

2.3.2 超声浸渍功率对胡萝卜中活菌数的影响

图5 超声浸渍功率对胡萝卜中活菌数的影响Fig. 5 Effect of ultrasonic power on the number of viable bacteria in carrot

如图5所示，超声浸渍功率对植物乳杆菌富集效果有明显作用，在一定范围内随功率增大，胡萝卜片富集的活菌数快速增多，但当功率在150 W后，活菌数快速减少。这是因为胡萝卜组织中的水分和微小气泡使得超声波的空穴作用极易产生，细胞膜结构受到破坏，细胞通透性增加[29-30]，加大传质速率，导致菌富集效果明显；另外随着空穴的不断形成及消失，形成的旋涡起到搅拌作用，也促进了菌的富集。但是随着功率继续增加，空穴作用加剧，温度升高，导致菌体的细胞结构损伤，活菌数减少。故选择超声浸渍功率为150 W。

2.3.3 超声浸渍时间对胡萝卜中活菌数的影响

图6 超声浸渍时间对胡萝卜中活菌数的影响Fig. 6 Effect of ultrasonic impregnation time on the number of viable bacteria in carrot

如图6所示，活菌数随着超声浸渍时间的延长呈现先缓慢上升后快速下降的趋势。在12 min前，超声浸渍时间延长，活菌数也随之增加，在经过一段时间的超声后，胡萝卜内外环境之间的物质交换会达到平衡，使得植物乳杆菌数不再增加，保持在一定范围内。但是超声超过12 min时活菌数明显下降，这可能是因为长时间的超声，破坏了植物乳杆菌的结构，增加菌体死亡数量。因此确定浸渍时间为12 min。

2.4 超声浸渍参数正交试验结果

2.4.1 超声浸渍正交试验设计结果

由表5可知，超声浸渍较优工艺参数为A1B1C3，即超声浸渍温度30 ℃、超声浸渍功率125 W、超声浸渍时间12 min时，通过超声浸渍胡萝卜片富集的活菌数最多。由表6可知，各因素的影响主次为超声浸渍时间＞超声浸渍温度＞超声浸渍功率。

表5 超声浸渍正交试验设计和试验结果Table 5 Orthogonal array design with experimental results for optimization of ultrasonic impregnation parameters

表6 超声浸渍正交试验设计方差分析Table 6 Analysis of variance of the orthogonal array design for optimization of ultrasonic impregnation parameters

2.4.2 验证实验

对正交试验优选出的超声浸渍最佳工艺参数进行验证实验，按照最佳工艺条件操作的胡萝卜片中的活菌数为9.93（lg（CFU/g）），高于表5中每一项试验结果，验证了所选取工艺条件的合理性。

2.5 3 种富集方式比较

2.5.1 不同富集方式下胡萝卜片中活菌数

图7 不同富集方式下胡萝卜中活菌数Fig. 7 Effect of impregnation methods on the number of viable bacteria in carrot

在较优工艺条件下真空浸渍、超声浸渍以及常压浸渍胡萝卜片中的活菌数如图7所示，通过真空浸渍富集的活菌数明显多于其他两种富集方式，达到1.2×1010CFU/g，而超声浸渍和常压浸渍富集的活菌数相当，没有明显差异（P＞0.05）。

2.5.2 不同富集方式下胡萝卜片中菌的附着情况

经真空浸渍、超声浸渍以及常压浸渍的富植物乳杆菌胡萝卜脆片表面和内部结构，见图8和图9。3 种浸渍方式制备的富植物乳杆菌胡萝卜表面均附着大量菌体。然而，在富植物乳杆菌胡萝卜组织内部只有真空浸渍组和超声浸渍组有菌体存在，常压浸渍组未发现菌体。说明通过这两种富集方式植物乳杆菌可以渗入并定植到胡萝卜组织内部而常压浸渍只是将菌体固定于胡萝卜组织表面。从植物乳杆菌在贮藏过程中的存活性角度，真空浸渍及超声浸渍可将菌富集到组织内部对菌应该有包埋保护作用，所以这两种富集方式优于常压浸渍。

图8 植物乳杆菌在胡萝卜表面附着情况Fig. 8 Lactobacillus plantarum adhesion on the surface of carrot cells

图9 植物乳杆菌在胡萝卜组织内部附着情况Fig. 9 Lactobacillus plantarum adhesion inside carrot cells

3 结 论

真空浸渍的较优工艺为真空浸渍温度35 ℃、真空浸渍时间15 min、复压浸渍时间20 min；超声浸渍较优工艺为超声浸渍温度30 ℃、超声浸渍功率125 W、超声浸渍时间12 min。以常压浸渍为对照，比较优化后真空浸渍、超声浸渍的植物乳杆菌富集效果可知，真空浸渍组活菌数最多，可达1.2×1010CFU/g。其他两种浸渍方式下的活菌数也都在106CFU/g以上，达到乳制品功能食品中含菌数标准。扫描电子显微镜结果显示，真空浸渍及超声浸渍都可将菌体定植于胡萝卜组织内部，而常压浸渍未进入组织内部。综合考虑，真空浸渍可作为较优的植物乳杆菌胡萝卜片的富集方式。

本研究将植物乳杆菌以物理方式富集到果蔬中，形成富植物乳杆菌果蔬产品，其活菌数能够保持106CFU/g以上，达到益生菌乳制品功能食品活菌数要求，此产品兼具果蔬和益生菌的优良品质，集营养保健于一体，可用于制备含益生菌鲜切果蔬、含益生菌果蔬脆片、含益生菌果蔬粉、益生菌的固定化载体等多种产品，具有广阔市场前景。同时比较了3 种浸渍方式富集益生菌的适用性，为真空浸渍在果蔬中应用提供新的科学依据。

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[30] ORDONEZ J A, SANZ B, HERNANDEZ P E, et al. A note on the effect of combined ultrasonic and heat treatments on the survival of thermoduric streptococci[J]. Journal of Applied Bacteriology, 1984, 56(1): 175-177. DOI:10.1111/j.1365-2672.1984.tb04711.x.

Optimization of Processing Parameters for Probiotics Enrichment in Impregnated Carrot Slices

CUI Li1, NIU Liying1, HUANG Jiapeng1, LI Dajing1, ZHANG Zhongyuan1, LIU Chunju1, LIU Chunquan1, LIU Yingping2, XIAO Lixia2,*
(1. Institute of Farm Product Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 2. School of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China)

This research aimed to develop probiotic foods by fortifying probiotics in carrot using vacuum or ultrasonic impregnation. The vacuum and ultrasonic impregnation conditions were optimized by one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods. The results showed that the optimum parameters for vacuum impregnation were obtained as temperature 35 ℃, impregnation time 15 min and restoration time 20 min and the optimum parameters for ultrasonic impregnation were temperature 30 ℃, ultrasonic power 125 W and impregnation time 12 min. The two techniques were compared with atmospheric pressure impregnation in terms of viable bacterial count and the results showed that the number of viable bacteria enriched by vacuum impregnation was the highest, reaching 1010CFU/g. Scanning electron microscopy (SEM) confirmed the presence of rod-shaped bacteria being embedded in the intracellular space of vacuum and ultrasonic impregnated carrot samples, which were not observed within the tissue of samples impregnated at atmospheric pressure. However, there was a large quantity of bacteria observed on the surface of the samples impregnated under all three conditions. Vacuum impregnation can be considered a new approach for fortifying probiotics in carrot. The results of this research may provide new ideas for the development of functional probiotic foods.

probiotics; carrot slices; vacuum impregnation; ultrasonic impregnation

10.7506/spkx1002-6630-201716029

TS255.52

A

1002-6630（2017）16-0183-07

崔莉, 牛丽影, 黄家鹏, 等. 胡萝卜片中富集植物乳杆菌的工艺优化[J]. 食品科学, 2017, 38(16): 183-189. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201716029. http://www.spkx.net.cn

CUI Li, NIU Liying, HUANG Jiapeng, et al. Optimization of processing parameters for probiotics enrichment in impregnated carrot slices[J]. Food Science, 2017, 38(16): 183-189. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201716029. http://www.spkx.net.cn

2017-01-12

江苏省重点研发计划（现代农业）重点项目（BE2016363）

崔莉（1978—），女，博士，研究方向为食品微生物与果蔬加工。E-mail：sunnycuili@gmail.com

*通信作者：肖丽霞（1966—），女，教授，博士，研究方向为农产品贮藏加工。E-mail：lxxiao@yzu.edu.cn