变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸激酶基因的克隆、表达及生物信息学分析

何小用，王大明，孙文敬,,*，崔凤杰,，钱静亚,，齐向辉，余泗莲

变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸激酶基因的克隆、表达及生物信息学分析

何小用1，王大明2,3，孙文敬1,2,*，崔凤杰1,2，钱静亚1,2，齐向辉1，余泗莲2

（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；2.百勤异VC钠有限公司，江西 德兴 334221；3.江南大学生物工程学院，江苏 无锡 214122）

采用聚合酶链式反应技术，从2-酮基葡萄糖酸工业生产菌株变形假单胞菌JUIM01中克隆2-酮基葡萄糖酸激酶的全长基因kguK，并在此基础上构建了重组菌株大肠杆菌BL21（DE3）/pET-28a（+）-kguK。在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的诱导下，该重组菌株表达了一个特异的分子质量约为36.0 ku融合蛋白，且该蛋白的Western-Blot鉴定结果显示为阳性。生物信息学分析结果表明，该蛋白是一种由305 个氨基酸残基组成的亲水性蛋白，定位于细胞质中，存在着与pfkB家族蛋白类似的保守结构域，其二级结构中α-螺旋、延伸链和无规则卷曲所占的比例分别为35.73%、12.79%和51.48%。

变形假单胞菌；2-酮基葡萄糖酸激酶；kguK基因；克隆；表达；生物信息学

假单胞菌（Pseudomonas）[1-4]属于氧化细菌（oxidative bacteria）[5-6]，其细胞质膜的周质侧存在着与呼吸链相连的葡萄糖直接氧化系统[7-10]。该系统由膜结合的葡萄糖脱氢酶和膜结合的葡萄糖酸脱氢酶[11-14]组成，能够在细胞的周质空间中催化氧化葡萄糖为食品抗氧化剂D-异抗坏血酸合成的前体——2-酮基葡萄糖酸（2-ketogluconic acid，2KGA）[15-19]。2KGA既可积累于假单胞菌的培养液中，也可被转运至其细胞质内而被分解代谢[7,20]。因此，开展2KGA代谢机理的研究对2KGA的发酵生产具有重要的指导意义。

到目前为止，有关2KGA的分解代谢的基因调控研究主要集中于恶臭假单胞菌（P. putida）[21-22]和致病性的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）[23]，几乎没有涉及到其他的假单胞菌，更未涉及到沙雷氏菌（Serratia）[24]、克雷伯氏菌（Klebsiella）[25-26]、醋酸杆菌（Acetobacter）[27]等能够生产2KGA的细菌菌株。相关研究结果[21-23]表明：由kguT、kguK、kguE和kguD等结构基因组成的kgu操纵子与2KGA的胞内磷酸化过程密切相关，这些基因分别编码2KGA转运蛋白（2-ketogluconate transporter，KguT）、2KGA激酶（2-ketogluconate kinase，KguK）、2KGA异构酶（2-ketogluconate epimerase，KguE）和2KGA还原酶（2-ketogluconate reductase，KguD）。另外，阻遏蛋白PtxS调控kgu操纵子的转录，同时调控其自身的合成[28-29]。

本研究以国内2KGA工业生产的主要用菌变形假单胞菌（P. plecoglossicida）JUIM01[30]为材料，对其KguK的编码基因kguK进行克隆和表达，并通过生物信息学方法分析和预测KguK蛋白的基本生物学特性，为后续的KguK蛋白纯化、鉴定及其酶学特性研究奠定基础，进而为2KGA高效生产菌株的构建提供相关的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株和质粒

变形假单胞菌（P. plecoglossicida）JUIM01 本实验室选育保藏；大肠杆菌（Escherichia coli）JM109、E. coli BL21（DE3）和质粒pET-28a（+） 本实验室保存；质粒pMD19-T 宝生物工程（大连）公司。

1.1.2 培养基

LB液体培养基：酵母提取物5.0 g/L、胰蛋白胨10.0 g/L、NaCl 10.0 g/L，pH 7.0。

LB固体培养基：在LB液体培养基中添加终质量浓度为15.0 g/L的琼脂。

1.1.3 试剂

细菌基因组提取试剂盒、2×Pfu PCR MasterMix天根生化科技（北京）有限公司；Anti-6×His antibody、HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit lgG、W-TMB显色试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、SanPrep柱式质粒DNA小量提取试剂盒、5×Protein Loading Buffer 生工生物工程（上海）股份有限公司；限制性内切酶EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、T4 DNA连接酶、DNA A-Tailing Kit、DL5 000 DNA Marker、Premixed Protein Marker（Low）宝生物工程（大连）公司；PageRulerTMPrestained Protein Ladder 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

TGL-18M型冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；XMTD-8222型恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；C1000 TouchTM型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪、PowerPac Basic型电泳仪、GelDocTMXR+型凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司；DYCZ-40A型电泳仪 北京市六一仪器厂；QL-901型旋涡混合器、TS-2型脱色摇床 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；UVG20型防紫外割胶仪 上海领成生物科技有限公司；FMB40型雪花制冰机、DC-2006型低温恒温槽 上海比朗仪器有限公司；HYL-C型组合式摇床 太仓市强乐实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 变形假单胞菌JUIM01基因组DNA的提取

将低温保存的变形假单胞菌JUIM01菌株涂布于LB固体培养基上，在37 ℃恒温培养箱中培养12 h。挑取JUIM01菌株的单菌落接种于30 mL的LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min振荡培养12 h，然后取适量菌液8 000 r/min离心收集菌体，并用无菌水洗涤菌体2 次。参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书，提取变形假单胞菌JUIM01基因组DNA，并在-20 ℃贮存备用。

1.3.2 PCR引物的设计与合成

根据GenBank中已公布的其他假单胞菌kguK基因的完整序列和变形假单胞菌JUIM01基因组的部分测序结果，采用同源比对的方法设计引物，设计的PCR引物如下：

P1：5’-CGGGATCCATGGCCATGTTCGTGGCCGA GCAGT-3’

P2：5’-GGAATTCTCAACCGCCGAAGCGGTCTTC GT-3’

其中，下划线部分分别为限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位点。

引物的合成委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3.3 目的基因片段的扩增

以变形假单胞菌JUIM01的基因组DNA为模板，采用引物P1和P2扩增kguK基因的全长片段。

PCR体系（25.0 μL）：2×Pfu PCR MasterMix 12.5 μL、引物P1（10 μmol/L）1.0 μL、引物P2（10 μmol/L）1.0 μL、基因组DNA 0.5 μL、ddH2O 10.0 μL。

PCR程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，反应32 个循环；72 ℃延伸5 min。1.3.4 变形假单胞菌kguK基因的克隆与测序

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，参照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书，对切胶获取的目的条带进行纯化回收。参照DNA A-Tailing Kit和pMD19-T Vector Cloning Kit说明书，将纯化得到的kguK基因片段加A尾，并进行T-A克隆，然后转化E. coli JM109的感受态细胞。在含有100 μg/mL的氨苄青霉素的LB平板（取40.0 μL的2.0 g/100 mL的X-Gal和7.0 μL的20.0 g/100mL的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactopyranoside，IPTG）混合后均匀涂布于平板表面）上进行蓝白斑筛选，挑取阳性单克隆。参照质粒DNA提取试剂盒说明书，提取重组质粒pMD19-T-kguK。对重组质粒进行双酶切（限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ）验证后，将阳性克隆子送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.3.5 异源表达载体的构建与鉴定

使用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ对重组质粒pMD19-T-kguK进行双酶切，然后采用1%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物；切胶获取kguK基因条带，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的DNA片段。此后，在T4 DNA连接酶作用下，将回收的目的基因片段与经过上述相同处理的表达载体pET-28a（+）连接（16 ℃连接16 h），并用该连接产物转化E. coli JM109的感受态细胞。取100 μL的转化菌液均匀涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基中，37 ℃培养12～16 h。从平板上挑取阳性单克隆，接种至含有50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min振荡培养12 h。参照质粒DNA提取试剂盒说明书，提取重组质粒pET-28a（+）-kguK并进行酶切验证。

1.3.6 重组菌的构建及重组蛋白的诱导表达

利用重组质粒pET-28a（+）-kguK转化E. coli BL21（DE3）的感受态细胞，然后将转化菌液均匀涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基中，37 ℃培养12～16 h。从平板上挑取阳性单克隆至含有50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中过夜振荡培养（37 ℃，200 r/min），然后以2%的接种量转接至相同的液体培养基中进行扩大培养（37 ℃，200 r/min）。当培养液的OD600nm达到0.6左右时，加入IPTG至终浓度为0.8 mmol/L，在20 ℃、200 r/min的条件下诱导表达12 h。

1.3.7 SDS-PAGE分析与Western-Blot鉴定

取经过诱导的细胞培养液1.0 mL，8 000 r/min离心2 min收集菌体，并用预冷的无菌PBS缓冲液洗涤2 次，然后使菌体重悬于100 μL的PBS缓冲液中。取20.0 μL的重悬菌液与5.0 μL的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上样缓冲液充分混匀，于100 ℃水中煮沸5 min。待样品冷却后，对其全细胞蛋白进行SDS-PAGE分析。

以Anti-6×His antibody（抗6×His单克隆兔抗）为一抗、HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit lgG（IgG/HRP羊抗兔）为二抗，以预染蛋白质分子质量标准PageRulerTMPrestained Protein Ladder为Marker，对经SDS-PAGE分离的KguK融合蛋白进行Western-Blot鉴定。

1.3.8 变形假单胞菌KguK蛋白的序列分析

采用DNAMAN软件进行基因序列和氨基酸序列的分析比对；使用ExPASy的ProtParam工具对kguK编码的蛋白质KguK的理化性质进行预测和分析；应用ExPASy的ProtScale工具在线分析蛋白的疏水性；应用TMHMM Server v. 2.0、SignalP 4.1 Server、Kinasephos和PSORT WWW Server中的PSORT Prediction在线工具分别预测目的基因编码蛋白的跨膜结构域、信号肽、激酶磷酸化修饰位点和亚细胞定位；利用PSIPRED V3.3在线分析工具分析蛋白的二级结构；采用ExPASy中COILS工具预测KguK蛋白的卷曲螺旋结构；使用InterProScan在线工具对KguK蛋白的保守结构域和功能位点进行分析；利用MEGA6.0软件构建蛋白的系统进化树；应用Swiss-Model在线工具进行同源模建，并用PDBsum Generate在线蛋白检测工具对预测的蛋白模型进行评估。

2 结果与分析

2.1 变形假单胞菌kguK基因片段的克隆

图1 变形假单胞kguK基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析Fig. 1 Agarose gel electrophoresis analysis of kguK PCR amplification products from P. plecoglossicida

以变形假单胞菌JUIM01的基因组为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到了一段长度约为900 bp的核酸片段（图1）。

采用DNA A-Tailing Kit对切胶回收的PCR产物进行处理后，经连接、转化、蓝白斑筛选和质粒提取等步骤，得到了重组质粒pMD19-T-kguK。在该质粒双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图谱（图2）中，存在2 条得到明显分离的条带，其中一条在大约900 bp处，另一条在大约2 700 bp处，与预期的结果一致。上述结果表明，重组质粒pMD19-T-kguK得到了正确的构建。

图2 重组质粒pMD19-T-kguK双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳分析Fig. 2 Electrophoretic analysis of the restriction enzyme-digested products of recombinant plasmid pMD19-T-kguK

图3 变形假单胞KguK的基因序列及氨基酸序列Fig. 3 Gene and amino acid sequences of KguK from P. plecoglossicida

由图3可知，克隆的基因片段的核苷酸序列长度为918 bp。DNAMAN分析结果表明，克隆的基因片段具有一个完整开放阅读框，其起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。利用BLAST进行同源性比对发现，本研究克隆的基因片段与P. putida NBRC 14164、P. putida KT2440、P. aeruginosa UCBPP-PA14、P. aeruginosa NCGM 1900和P. fluorescens F113的编码KguK的基因片段在核苷酸序列上的一致性分别为71.91%、71.59%、67.61%、67.51%和64.37%，初步认为该序列为变形假单胞菌JUIM01编码KguK的基因序列。本研究克隆的变形假单胞菌JUIM01的kguK基因序列已被递交至GenBank数据库，登录号为KU168043。

2.2 异源表达载体的构建

对重组质粒pMD19-T-kguK和表达载体pET-28a（+）分别进行双酶切处理，经电泳分离、DNA回收、连接、转化、抗性筛选和质粒提取等步骤，得到了重组质粒pET-28a（+）-kguK。1%琼脂糖凝胶电泳分析结果（图4）表明：重组质粒pET-28a（+）-kguK的单酶切（BamHⅠ处理）产物显示为长度约为6 300 bp的单一条带，与预期的结果相符；重组质粒pET-28a（+）-kguK的双酶切（BamHⅠ和EcoRⅠ处理）产物显示为长度分别为5 400 bp左右和900 bp左右的2 条条带，与预期的结果一致。上述研究结果证明，基因kguK已成功构建到表达载体pET-28a（+）-kguK中。

图4 重组质粒pET-28a（＋）-kguK酶切产物的琼脂糖凝胶电泳分析Fig. 4 Electrophoretic analysis of the restriction enzyme-digested products of recombinant plasmid pET-28a(+)-kguK

2.3 重组菌的构建及重组蛋白的诱导表达

图5 重组菌株E. coli BL21（DE3）/pET-28a（+）-kguK全细胞蛋白的SDS-PAGE分析Fig. 5 SDS-PAGE analysis of the whole-cell proteins extracted from E. coli BL21(DE3)/ pET-28a(+)-kguK

利用重组质粒pET-28a（+）-kguK转化E. coli BL21（DE3）的感受态细胞，经抗性筛选得到了重组菌E. coli BL21（DE3）/pET-28a（+）-kguK。SDS-PAGE分析结果（图5）表明：在相同的诱导条件下，重组菌E. coli BL21（DE3）/pET-28a（+）-kguK表达出分子质量约为36.0 ku的融合蛋白（其中标签蛋白的分子质量约为3.5 ku），而E. coli BL21（DE3）和E. coli BL21（DE3）/ pET-28a（+）的全细胞蛋白中没有该蛋白的存在。

图6 重组菌株E. coli BL21（DE3）/pET-28a（+）-kguK表达的融合蛋白的Western-Blot分析Fig. 6 Western-Blot analysis of the protein expressed by E. coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-kguK

对经过SDS-PAGE分离的重组蛋白进行Western-Blot鉴定，结果如图6所示。E. coli BL21（DE3）/pET-28a（+）-kguK表达的融合蛋白的鉴定结果显示为阳性，进一步证明了变形假单胞菌JUIM01的kguK基因在E. coli BL21（DE3）中的成功表达。

2.4 变形假单胞菌KguK蛋白的生物信息学分析

2.4.1 变形假单胞菌KguK的基本理化性质预测

采用ExPASy的ProtParam工具进行的分析结果表明：KguK蛋白由305 个氨基酸残基组成，其中带负电荷的氨基酸残基（Asp+Glu）总数为37 个，带正电荷的氨基酸残基（Arg+Lys）为31 个。该蛋白的理论分子质量和等电点分别为32.5 ku和5.47，分子式为C1417H2265N423O429S14。KguK蛋白在溶液中的不稳定指数为40.78（＞40），说明该蛋白在溶液中性质不稳定。KguK的脂溶性指数为92.20，总平均亲水指数为-0.032，预测该蛋白为亲水性蛋白，但亲水性较低。采用ExPASy的ProtScale工具对KguK蛋白进行疏水性分析发现，该蛋白为亲水性蛋白，预测结果与上述结果一致。

2.4.2 变形假单胞菌KguK的跨膜结构、细胞定位、信号肽及潜在激酶磷酸化位点预测

采用TMHMM Server v. 2.0进行的预测显示，KguK蛋白无跨膜结构域，为非跨膜蛋白。利用PSORT Prediction进行的预测结果表明，KguK蛋白定位于细胞质中。采用SignalP 4.1 Server对KguK蛋白的氨基酸序列进行N端信号肽的预测结果显示，该蛋白无信号肽。

采用NetPhos2.0在线分析工具对KguK蛋白中潜在的苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸的激酶磷酸化位点进行分析，结果显示：KguK蛋白中可能存在10 个丝氨酸激酶磷酸化修饰位点（第50、99、100、103、106、130、132、150、160、283位氨基酸）、4 个苏氨酸激酶磷酸化修饰位点（第167、193、197、230位氨基酸）和2 个酪氨酸激酶磷酸化修饰位点（第223、299位氨基酸）。

2.4.3 变形假单胞菌KguK的二级结构及卷曲螺旋预测

通过PSIPRED V3.3在线分析工具对KguK蛋白的二级结构进行了预测，结果显示：KguK蛋白二级结构中具有α-螺旋、延伸链以及无规则卷曲3 种结构，所占比例分别为35.73%、12.79%和51.48%。

卷曲螺旋是蛋白质中2～7 条α-螺旋链互相缠绕形成类似麻花状结构的总称，存在于转录因子、膜蛋白、酶等蛋白质中，具有分子识别、膜通道和代谢调控等生物学功能。使用COILS server预测了蛋白KguK的卷曲螺旋结构，结果显示：在3 种不同的窗口宽度下的检测值均较低，表明KguK蛋白中可能不存在卷曲螺旋结构。

2.4.4 变形假单胞菌KguK的结构域和功能位点分析

InterPro数据库整合了蛋白家族、结构域和功能位点等数据库资源，如SMART、Pfam、TIGRFAMs、ProDom、PROSITE、PRINTS等常用数据库，检测结果的准确度较高。使用InterProScan在线工具分析KguK蛋白的结构域和功能位点，结果表明，KguK蛋白存在PfkB蛋白结构域，具有磷酸转移酶活性，受体基团为醇基，其保守位点位于第244～257个氨基酸残基之间。

2.4.5 变形假单胞菌KguK的系统进化分析

图7 KguK蛋白的系统进化树Fig. 7 Phylogenetic tree of KguK proteins from Pseudomonas

通过BLAST搜索，从NCBI数据库中获得了变形假单胞菌KguK的同源序列，然后利用ClustW软件进行多序列同源性多重比对，采用MEGA6.0软件对7 个不同来源的氨基酸序列进行系统进化分析。分析结果（图7）表明，变形假单胞菌JUIM01的KguK与P. putida NBRC 14164的KguK的同源性较高，在氨基酸序列上的一致性达73.82%。

2.4.6 变形假单胞菌KguK的三级结构预测与检验

利用Swiss-Model在线预测工具，采用自动模式对变形假单胞菌JUIM01的KguK蛋白的三级结构进行同源模建，选取与KguK蛋白同源性最高的PfkB蛋白（4du5.1A）为模板，模拟KguK蛋白的三级结构，结果如图8所示。

图8 变形假单胞菌JUIM01蛋白KguK的三级结构Fig. 8 Tertiary structure of KguK from P. plecoglossicida JUIM01 predicted by Swiss-model

图9 变形假单胞菌JUIM01蛋白KguK的拉氏构象图Fig. 9 Ramachandran diagram of KguK from P. plecoglossicida JUIM01

采用PDBsum Generate工具对预测结果进行评估，结果如图9所示。根据构象的稳定性，拉氏构象图被分为4 个区域，即最佳区、次允许区、一般区和不允许区。一般认为，最佳区达90%以上、不允许区低于1%的模型结构的稳定性较好。对变形假单胞菌KguK三级结构预测模型的评估结果显示，上述4 个区域的统计数据分别为93.7%、6.3%、0.0%和0.0%，表明所构建的KguK蛋白三级结构模型的质量较高。

3 结 论

采用PCR技术，从工业生产菌株变形假单胞菌JUIM01克隆了与2KGA代谢密切相关的KguK的全长基因，其核苷酸序列长度为918 bp。利用所克隆的基因kguK，构建了重组菌E. coli BL21（DE3）/pET-28a（+）-kguK。在IPTG的诱导下，该重组菌表达了一个特异性的分子质量约为36.0 ku的融合蛋白（其中标签蛋白的分子质量约为3.5 ku）。该重组蛋白的Western-Blot鉴定结果显示为阳性，进一步证明了变形假单胞菌JUIM01的kguK基因在E. coli BL21（DE3）中的成功表达。

生物信息学分析结果表明：变形假单胞菌KguK是由305 个氨基酸残基组成的亲水性蛋白，理论分子质量为32.5 ku，定位于细胞质中，无跨膜结构和信号肽。变形假单胞菌KguK存在一个保守结构域，与pfkB家族蛋白的保守结构域类似。在该蛋白的氨基酸序列上，存在着16 个潜在的激酶磷酸化修饰位点。在该蛋白的二级结构中，α-螺旋、延伸链和无规则卷曲3 种结构形式所占的比例分别为35.73%、12.79%和51.48%。

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Cloning, Expression and Bioinformatic Analysis of 2-Ketogluconate Kinase Gene from Pseudomonas plecoglossicida

HE Xiaoyong1, WANG Daming2,3, SUN Wenjing1,2,*, CUI Fengjie1,2, QIAN Jingya1,2, QI Xianghui1, YU Silian2
(1. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China; 2. Parchn Sodium Isovitamin C Co. Ltd., Dexing 334221, China; 3. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

The full-length sequence of 2-ketegluconate kinase gene (kguK) from was cloned from an industrial 2KGA producer of Pseudomonas plecoglossicida JUIM01 and expressed in the recombinant strain Escherichia coli BL21(DE3)/ pET-28a(+)-kguK with isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside induction. The specific fusion protein KguK had a molecular weight of about 36.0 ku, which was confirmed by Western-Blot. The bioinformatics analysis showed that KguK in P. plecoglossicida was a hydrophilic protein with 305 amino acid residues. It was located in the cytoplasm, having a conserved domain similar to that of the pfkB family. The predicted secondary structure contained 35.73% of α-helixes, 12.79% of extended strand and 51.48% of random coil.

Pseudomonas plecoglossicida; 2-ketegluconate kinase (KguK); kguK gene; cloning; expression; bioinformatics

10.7506/spkx1002-6630-201716002

Q781

A

1002-6630（2017）16-0010-07

何小用, 王大明, 孙文敬, 等. 变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸激酶基因的克隆、表达及生物信息学分析[J]. 食品科学, 2017, 38(16): 10-16. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716002. http://www.spkx.net.cn

HE Xiaoyong, WANG Daming, SUN Wenjing, et al. Cloning, expression and bioinformatic analysis of 2-ketogluconate kinase gene from Pseudomonas plecoglossicida[J]. Food Science, 2017, 38(16): 10-16. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716002. http://www.spkx.net.cn

2016-11-08

国家自然科学基金面上项目（31571885）；国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2012AA022103）；江西省科技计划项目（赣知发[2015]64号）；江西省创新团队建设计划项目（20142BCB24024）；江西省科技平台建设计划项目（2010DTZ01900）；德兴市科技计划项目（德科发[2015]44号）

何小用（1989—），男，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：hxy9808@126.com

*通信作者：孙文敬（1964—），男，研究员，博士，研究方向为工业生物技术。E-mail：juswj@163.com