转录组解析白三叶根际溶磷菌株RW8的解磷机制

李小冬，王小利，陈锡，蔡璐，曾庆飞，舒健虹，蔡一鸣

(贵州省农业科学院草业研究所,贵州 贵阳 550006)

转录组解析白三叶根际溶磷菌株RW8的解磷机制

李小冬，王小利，陈锡，蔡璐，曾庆飞，舒健虹，蔡一鸣*

(贵州省农业科学院草业研究所,贵州 贵阳 550006)

采用转录组测序的方法分析了白三叶根际溶磷菌RW8在含有难溶磷(A组)、可溶磷(B组)与无磷(C组)培养条件下差异基因表达。以可溶磷为对照，在难溶磷条件下，分别检测到4782个基因在RW8中上调表达，447个基因下调表达；在无磷组中，共检测到3630个基因上调表达，209个基因下调表达。GO基因注释发现RW8在A组和C组中的差异基因聚类基本相同。生物学过程主要聚类在代谢过程、细胞过程、单细胞过程、刺激应答、定位以及生物反应调节；细胞组分主要聚类在细胞组分、细胞膜、膜组分与高分子配合体等；分子功能主要聚类在催化活性、结合功能与转运功能。代谢途径分析发现2-α-氧代羧、α-亚麻酸、五碳二元酸、脂肪酸、甘氨酸-丝氨酸-蛋氨酸以及缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸等代谢途径的基因显著被富集。挑选10个差异基因并用荧光定量检测其在A、B、C 3种不同培养条件下的基因表达，发现所有挑选基因的表达变化与转录组结果变化趋势相同。液相色谱检测有机酸组成及含量，发现在A组和C组中乳酸、琥珀酸与柠檬酸显著高于B组，富马酸与苹果酸的含量在C组中显著升高， A组与B组差异不显著；α-酮戊二酸的含量在A组中显著增高, B组和C组差异不显著。

溶磷菌；白三叶；转录组；RW8；有机酸

植物根际促生细菌是指定殖在植物根际、根内或自由生活在土壤中并对植物生长、抵抗逆境胁迫和增加作物产量有积极作用的微生物[1]。固氮菌、溶磷菌、分泌植物激素菌以及具有多种功能的复合菌是目前根际促生菌研究的热点[2]。随着污染日益严重，利用优良促生菌株研制环境友好型菌肥用以替代化学肥料、改良土质、增进土壤肥力是新型生态肥料的发展方向之一[3]。

豆科牧草与根瘤菌共生，可固定大气中的氮气为自身提供氮素营养，往往含有较高的粗蛋白；同时作为绿肥对改良土壤与提高土壤肥力有积极作用。近年来，豆科牧草根际微生物(尤其是固氮菌)的研究较多，主要集中在根瘤菌的分离鉴定[4]及资源库的建立以及不同资源的比较[5-6]等方面，而对于溶磷菌的研究还比较少。以往的研究发现溶磷菌不仅可为豆科牧草提供必需的营养，还影响豆科植物的结瘤及固氮能力，协同促进植物对钾、钙、镁等营养元素的吸收[7]。然而溶磷微生物的溶磷过程非常复杂，加之种类丰富，溶磷机理也具有菌种特异性。马文彬[3]总结了溶磷菌解磷主要是与酸解作用、酶解作用以及蛋白质作用等途经相关，而龚明波[8]认为主要是由有机酸、溶磷酶、H+释放、氧化还原物质与其他溶磷物质(蛋白质、多糖、氨基酸等)，然而这些结论是基于表型或者生理研究获得，其相应的分子机制研究还较少。

溶磷菌分子生物学研究开展较早，Goldstein等[9]从草生欧文菌(Erxwiniaherbicola)中克隆毗咯并喹啉醌合成基因pqqE,并证明其有溶解无机磷的能力。Babukhan等[10]从洋葱假单胞菌(Pseudomonascepacia)中克隆基因gabY,其与pqqE基因不是同一类基因[11-12]。pqqE与gabY基因都与溶解土壤中的无机磷有关，有机磷降解的基因主要分为酸性磷酸酶(acpA、phoC和napA)、碱性磷酸酶(phoA和phoB)和肌醇六磷酸酶基因(phy)[8,13-14]。最近的研究发现大豆根际溶磷菌解磷能力与葡萄糖脱氢酶(GDH)相关[15]，然而通过组学研究溶磷菌解磷机制的报道还比较少，本研究以前期鉴定的白三叶根际溶磷菌RW8为基础，采用转录组学的方法分析了RW8在含难溶磷、可溶磷以及无磷培养基中的基因表达差异，发现RW8解磷机制与有机酸代谢通路紧密相关。本研究为在南方岩溶山区开展磷高效利用，建立低磷投入的生态农场奠定基础。

1 材料与方法

1.1 溶磷菌RW8培养

溶磷菌RW8菌株是2010年10月贵州省草业研究所从白三叶根际土壤样品分离获得，经鉴定为阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)。为进一步分析RW8溶磷机制，将RW8分别接种在含有3种不同磷源的培养基中，每种培养条件接种3个重复，28 ℃、150 r/min振荡培养7 d；10000 r/min室温离心10 min收集菌体，提取不同生长条件下RW8溶磷菌的RNA，保存在-80 ℃冰柜中待测。培养基配方，A)难溶性磷培养基：3 g/L Ca3(PO4)2，10 g/L葡萄糖，0.5 g/L (NH4)2SO4，0.2 g/L NaCl，0.2 g/L KCl，0.03 g/L MgSO4·7H2O，0.03 g/L MnSO4，1000 mL无菌水，0.003 g/L FeSO4·7H2O，pH值6.8。B)可溶性磷培养基：用3.02 g/L NaH2PO4·2H2O 代替3 g/L Ca3(PO4)2，其他成分与难溶培养基相同。C)无磷培养基：用6.85 g/L Ca(NO3)2·4H2O代替3 g/L Ca3(PO4)2，其他成分与难溶培养基相同。

1.2 RNA提取与文库构建

用Trizol试剂提取3种培养条件下RW8的总RNA，采用安捷伦分析仪(Bioanalyzer 2100)分析浓度与完整性后，将相同培养条件的3份RNA样品(生物学重复)混为1份样品，用Oligo-dT磁珠提取mRNA，并利用随机6碱基引物反转录成cDNA第一链，第二链合成采用DNA聚合酶I 和RNaseH。随后经过T4DNA聚合酶等进行末端补齐，在T4DNA快速连接酶作用下与测序接头链接，随后进行凝胶电泳，分离回收目标片断条带，经安捷伦分析仪(Bioanalyzer 2100)分析合格后采用Illumina HiSeq 2500进行测序分析，测序在华大基因完成。

1.3 序列组装与功能注释

转录组数据采用Trinity软件进行组装[16]，获得的序列称为功能基因(Unigene)，利用聚类软件对功能基因家族进行聚类分析，并将功能基因分成2类，一类以“comp”为前缀，与聚类ID一起命名。另一类以“Unigene”为前缀，与聚类ID号一起命名。将获得的功能基因与NR(Non-Redundant GenBank)、KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)等数据库进行比对，选取最佳的比对结果用于功能基因的注释。

1.4 差异表达基因鉴定与功能聚类

差异表达基因的鉴定参考Audic等[17]的研究方法，采用FDR统计方法同时分析不同样品的 FPKMs[18]，FDR值越小，差异表达变化的可信度越大，本研究差异基因的筛选标准为FDR≤0.001，并且表达差异变化≥2倍的基因。在基因注释数据库(http://www. geneontology. org/)对差异基因注释并统计每个注释项目的数目，同时利用Blastall程序在KEGG数据库分析差异基因的代谢通路。在全基因组背景条件下，用超几何测算分析GO注释中富集的注释项目以及KEGG中富集的代谢通路。

1.5 RNA提取与荧光定量分析

RNA提取与反转录PCR参考文献[19]，参照1.1培养10 mL菌液，采用Axygen RNA试剂盒(AP-MN-MS-RNA-50)提取RNA，cDNA第一链合成采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，具体操作过程参照试剂盒说明书。荧光定量PCR利用Eppendorf Replax 2完成，利用稀释20倍的cDNA作为模板，荧光定量引物利用在线软件http://www.idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest设计，引物序列参照表1。PCR的程序为：95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，45个循环，72 ℃ 10 min，从65 ℃缓慢升温95 ℃，每0.5 ℃收集一次荧光信号用于制作溶解曲线，采用2-ΔΔct算法，每个样品3个生物学重复，每个生物学重复3个技术重复，16S rDNA被用作内参。

表1 荧光定量引物

1.6 液相色谱分析有机酸的含量

参照1.1的方法在3种不同磷源的培养基中培养RW8溶磷菌株，28 ℃、150 r/min振荡培养7 d；10000 r/min室温离心10 min收集上清培养液，用0.45 μm的微孔滤膜过滤。取20 μL的样品上机检测。采用高效液相色谱(HPLC)分析有机酸的含量，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填料(C-18，150×3.9 mm，walers)，流动相为pH=2.65的双蒸水(磷酸调配)，流速为0.4 mL/min，柱温20 ℃。根据标准品峰图比对结果测定不同培养条件下RW8菌株的有机酸分泌量。

1.7 数据分析

采用Excel 2010进行数据分析与作图，采用PowerPoint 2010进行图片排版。

2 结果与分析

2.1 磷菌RW8转录组序列分析

分别从含有难溶磷(A)、可溶磷(B)与无磷(C)培养条件下的RW8菌株中提取3组RNA样品，分别进行建库后采用Illumina HiSeq 2500测序分析。A、B、C三个文库分别获得26313180、16279622与18762865条序列，Q30值(测序准确性的衡量指标)分别为94.30%、93.99%与93.87%。采用Trinity软件组装测序文件，一共获得9097个序列重叠群，平均长度为946.62 bp，GC含量为55.37%(表2)。

2.2 差异基因统计与功能注释GO聚类分析

与可溶性磷(B组)相比，RW8在含难溶磷培养条件下(A组)共检测到4782个基因上调， 447个基因下调表达；在无磷条件下(C组)共检测到3630个基因上调表达，209个基因下调表达。通过GO功能聚类对RW8在不同磷源条件下的差异基因按照GO的生物学过程、细胞组分与分子功能3个主要类别进行分类。

表2 不同培养条件下RW8测序结果

U-P: 难溶性磷Un-soluble phosphorus; S-P: 可溶性磷Soluble phosphorus; N-P: 无磷None phosphorus; 下同The same below.

生物学过程聚类比较发现，与B组对比发现， A组上调基因数目远远大于下调基因，但是两者超过70%的差异基因都集中在代谢过程、细胞过程与单细胞过程这3项，之后依次为刺激应答、定位与生物反应调节这3项(图1A)。C组与A组类似，上调基因数目显著大于下调基因数，生物学过程聚类发现超过70%的基因集中在代谢过程、细胞过程与单细胞过程这3项，其次依次为定位、刺激应答与生物反应调节这3项(图1B)。

细胞组分聚类分析发现， A组超过60%的差异基因能定位到细胞组分，上调基因主要定位于细胞膜、膜组分与高分子配合体，而下调基因主要定位于高分子配合体、细胞膜与膜组分等(图2A)，C组差异基因细胞组分聚类总体趋势与A组基本相同，但在C组中的下调基因在高分子配合物、细胞器以及细胞器组分中的富集程度相对没有A组明显(图2)。

分子功能聚类分析发现， A组与C组的上调基因主要聚类到催化活性、结合功能与转运功能这3项(图3)。而A组下调基因中的结构分子聚类组显著被富集，C组的下调基因中转运功能聚类组被显著富集(图3)。

2.3 差异基因代谢途经分析

为进一步研究差异基因参与的代谢途径，将所有的差异基因在KEGG数据库中分析，发现有机酸代谢通路显著富集，其中2-α-氧代羧代谢，α-亚麻酸代谢，五碳二元酸代谢，脂肪酸代谢，甘氨酸-丝氨酸-蛋氨酸代谢以及缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸代谢等途径的基因显著上调。

在2-α-氧代羧代谢途径中，与乙酰化途径显著相关的基因显著被上调(至少在1组中差异达显著水平)，其中包括乙酰乳酸合成酶及其同工酶(6个)、乙酰醇酸还原异构酶(1个)、乙酰琥珀酸转氨酶(1个)、乙酰氨基转移酶(1个)以及N-乙酰基-γ-谷氨酰磷酸还原酶(1个)。与B组相比，A组与C组基因的表达变化趋势基本相同，其中柠檬酸合成途径的基因表达变化在A组与C组中上调幅度都较大，而乙酰乳酸合成酶在A组中相对较高(表3)。除此之外，与2-α-氧代羧代谢途径紧密相关的氨基酸包括天冬氨酸、精氨酸、谷氨酸、苯胺酸等相关的关键酶的基因表达都被上调表达(表3)。

图1 RW8在难溶磷(A)与无磷(B)条件下差异基因的生物学过程聚类分析Fig.1 Biological process ontology of RW8 genes under culture mediums with un-soluble phosphorus (A) and without phosphorus (B)U-P: 难溶性磷Un-soluble phosphorus; N-P: 无磷None phosphorus; 下同The same below.

脂肪酸代谢途径中，脱氢酶类与硫解酶类基因显著被上调(至少在1组中差异达显著水平)。脱氢酶包括7个乙醇脱氢酶、3个醛醇脱氢酶、4个酰基辅酶A脱氢酶以及1个戊二酰辅酶A脱氢酶。硫解酶类包括5个3-酮脂酰辅酶A硫解酶、1个β-酮硫解酶以及1个β-酮己二酰辅酶A硫解酶。除此之外，还有4个乙酰-CoA乙酰基转移酶、2个长链脂肪酸-辅酶A连接酶、2个脂肪酸氧化复合物α亚基、1个酰基辅酶A氧化酶与1个烯酰-CoA水合酶被上调表达(表4)。与2-α-氧代羧代谢途径类似， A组与C组基因的表达变化趋势基本相同，都呈上调表达，但富集数目最多的脱氢酶、硫解酶与乙酰-CoA乙酰基转移酶基因在C组中的上调幅度高于A组(表4)。

在2-α-氧代羧代谢途径与脂肪酸代谢途径中，都发现了一部分基因只特异的在C组中差异表达而在A组表达差异不显著。这些基因分布在不同基因家族，包括乙酰乳酸合成酶同工酶1大亚基、乙酰/琥珀转氨酶、乙酰氨基转移酶、异柠檬酸脱氢酶、醛醇脱氢酶、P-450/ NADPH-P450还原酶、乙醇脱氢酶、酰基辅酶A氧化酶等多种，这些基因可能在难溶性磷溶解后的吸收过程中起十分重要的作用(表3，表4)。

图2 RW8在难溶磷(A)与无磷(B)条件下差异基因的细胞组分聚类分析Fig.2 Cellular component ontology of RW8 genes under culture mediums with un-soluble phosphorus (A) and without phosphorus (B)

2.4 荧光定量分析

为验证转录组数据的可靠性，从2-α-氧代羧代谢与脂肪酸代谢这2条主要途径中挑选候选10个基因进行荧光定量表达验证，其中除了3-酮脂酰辅酶A硫解酶(comp20313_c0)与超长链特异性的酰基辅酶A脱氢酶(comp28850_c0)只在无磷组中上调表达外，其余挑选基因在难溶磷和无磷组都显著高于可溶磷组(图4)，荧光定量的总体变化趋势与转录组数据吻合。

图3 RW8在难溶磷(A)与无磷(B)条件下差异基因的分子功能聚类分析Fig.3 Molecular function ontology of RW8 genes under culture mediums with un-soluble phosphorus (A) and without phosphorus (B)

2.5 有机酸含量的测定

转录组与荧光定量结果都表明RW8的有机酸合成的关键基因表达在A和C组中都显著上调表达，而且在前期定性测定中发现，培养基中的总有机酸含量在接种RW8菌种后显著增加，但具体是哪种有机酸还没深入研究，采用液相色谱技术分析了有机酸的组成与含量，与B组相比，RW8的乳酸、琥珀酸与柠檬酸含量在A与C组中显著增加(P<0.05，图5)，富马酸与苹果酸的含量在C组中显著升高(P<0.05，图5)，但A与B组差异不显著；α-酮戊二酸的含量在A组中显著增高(P<0.05，图5)，而在B和C组中只有痕量的α-酮戊二酸能被检测到，并且两者差异不显著(P>0.05，图5)。

表3 2-α-氧代羧代谢途径差异基因表

注：NA表示没有对应基因表达值在U-P与N-P之间不能取对数分析，Yes表示比较组之间差异显著，No表示比较组之间差异不显著，下同。

Note：NA stands for the gene expression value was unable to be expressed as log 2. Yes/No stand for a significant/insignificant difference were detected, the same below.

3 讨论

表4 脂肪酸代谢途径差异基因

图4 荧光定量PCR分析2-α-氧代羧与脂肪酸代谢途径基因差异表达Fig.4 Quantitative expression analysis of selected genes related to 2-oxocarboxylic acid metabolism and fatty acid metabolism

图5 液相色谱分析RW8在3种不同培养条件下有机酸含量与种类的变化Fig.5 Different organic acid concentration of RW8 cultured in three different medium detected by liquid chromatography-mass spectrometry

*表示差异在P<0.05水平显著。* stands for a significant difference atP<0.05 level.

植物在自然生长环境中存在大量微生物，最近的研究表明土壤益生菌与植物之间存在广泛的相互作用，有些能够广谱地促进植物生长，有些具有物种特异性[20]。溶磷菌是植物最重要的促生微生物之一，其种类与数量很多，有超过5种真菌和13种细菌被报道具有溶磷能力[7,21-23]。不同菌株的解磷能力主要受遗传特性、 培养条件与培养时间等因素的影响[24]。本研究利用的RW8菌种属于阴沟肠杆菌，前人研究发现肠杆菌属的溶磷菌对无机磷和有机磷都有很好的溶解能力， 并已被开发为生物菌肥[25]与有机农药降解菌[26]。 然而， 其解磷机制特别是从基因组或转录组的水平解析其机理的研究还较少，本研究通过比较分析RW8在含有难溶磷、可溶磷与无磷培养条件下的基因表达与代谢通路等差异，为发现RW8应答低磷胁迫与促进难溶磷溶解等生物学过程奠定分子基础，对其他菌种开展类似研究有一定的借鉴意义。

与可溶磷相比，在含有难溶磷和无磷的培养条件下,RW8差异基因的GO聚类基本相同(图1～3)，说明RW8可能在生长的早期经历了一个与无磷培养条件类似的低磷胁迫。难溶磷与无磷共同变化的基因可能参与低磷胁迫诱导，而两者之间差异基因可能是潜在参与难溶磷溶解的关键基因。基于此设想，难溶磷降解基因可能与代谢过程的定位和刺激应答相关(图1)，主要定位于细胞膜、高分子配合体、细胞器及其组分(图2)，参与转运与结构分子等生物学功能(图3)，更精确的结果还有待后续研究证明。

酸解作用途径被认为是溶磷机理的主要方面[27-28]，在之前的研究中发现RW8解磷与其分泌有机酸紧密相关，本研究发现多条与有机酸紧密相关的代谢通路基因被上调表达，并重点分析了2-α-氧代羧代谢途径与脂肪酸代谢途径，与GO聚类类似，差异基因在难溶磷与无磷组中的变化总趋势相同，但也有部分基因只在难溶磷或无磷组中差异显著(表3～4)，说明其可能参与了低磷胁迫诱导与难溶磷降解。

溶磷真菌主要分泌乳酸、草酸、丙二酸等，而溶磷细菌主要分泌葡萄糖酸、乳酸、草酸、2-酮戊二酸、苹果酸、柠檬酸和琥珀酸等[29]。RW8主要检测到了乳酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、富马酸和2-酮戊二酸(图5)，符合其为溶磷细菌特征。在所检测到的有机酸中，乳酸、琥珀酸与柠檬酸在难溶磷和无磷组中都显著受低磷诱导，而富马酸与苹果酸只在难溶磷组中受诱导(图5)，说明乳酸、琥珀酸与柠檬酸受诱导需要磷元素含量的阈值较高，而富马酸与苹果酸需要的阈值较低。2-酮戊二酸只在难溶磷中显著被诱导，其可能是RW8降解难溶磷的主要功能有机酸(图5)，因为不同的有机酸在解磷过程中的功能存在显著差异，并且具有菌种特异性[30-31]。

References：

[1] Malik K A, Bilal R, Mehnaz S,etal. Association of nitrogen-fixing, plant-growth-promoting rhizobacteria (PGPR) with kallar grass and rice. Plant and Soil, 1997, 194(1/2): 37-44.

[2] Guan P. The Effect of PGPR Fertilizers on the Growth and Quality of Alfalfa under the Different Soil Conditions[D]. Harbin: Harbin Normal University, 2014. 管鹏. 施用 PGPR 菌肥对不同土壤条件下的苜蓿生长及品质的影响[D]. 哈尔滨: 哈尔滨师范大学, 2014.

[3] Ma W B. Screening Plant Growth Promoting Rhizobacteria Resources and their Characteristics of Legumes[D]. Lanzhou: Gansu Agriculture University, 2015. 马文彬. 9种豆科牧草根际促生菌筛选及特性研究[D]. 兰州: 甘肃农业大学, 2015.

[4] Wang X C, Ma X T, Han M,etal. Screening of rhizobia of common vetch (Viciasativa) in Qinghai, and assessment of symbiont salt tolerance. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(8): 145-153. 王雪翠, 马晓彤, 韩梅, 等. 青海箭筈豌豆根瘤菌的筛选及其共生体耐盐性研究. 草业学报, 2016, 25(8): 145-153.

[5] Li Y M, Zhong Y Z, Tan Y,etal. Diversity of rhizobia nodulatingAstragalussinicus,MedicagosativaandTrifoliumrepensin nodulated soybean rhizosphere soil in Sichuan. Chinese Journal of Applied & Environmental Biology, 2015, 21(2): 234-241. 李艳梅, 钟宇舟, 谭渊, 等. 四川地区结瘤大豆根际土壤中紫云英、苜蓿和三叶草根瘤菌的多样性分析. 应用与环境生物学报, 2015, 21(2): 234-241.

[6] Wu T, Yao H Y, Mo B T,etal. The category and distribution of arbuscular mycorrhizal fungi from the rhizosphere of eight cultivated Leguminous shrubs. Pratacultural Science, 2016, 33(2): 210-218. 吴涛, 姚红艳, 莫本田, 等. 8种豆科灌木栽培种丛枝菌根真菌种类及分布. 草业科学, 2016, 33(2): 210-218.

[7] Peix A, Rivas-Boyero A A, Mateos P F,etal. Growth promotion of chickpea and barley by a phosphate solubilizing strain ofMesorhizobiummediterraneumunder growth chamber conditions. Soil Biology & Biochemistry, 2001, 33(1): 103-110.

[8] Gong M B. Screening and Application of Phosphate-dissolving Stains and Its Gene Cloning and Identification[D]. Beijing: Graduate School of Chinese Academy of Agriculture Sciences, 2011. 龚明波. 溶磷微生物分离、应用及其相关基因的克隆与功能鉴定[D]. 北京: 中国农业科学院, 2011.

[9] Goldstein A H, Liu S T. Molecular cloning and regulation of a mineral phosphate solubilizing gene fromErwiniaherbicola. Nature Biotechnology, 1987, 5(1): 72-74.

[10] Babukhan S, Yeo T C, Martin W L,etal. Cloning of a mineral phosphate-solubilizing gene fromPseudomonascepacia. Applied & Environmental Microbiology, 1995, 61(3): 972-978.

[11] Zhao K. Phosphorus Dissolving Aspects of Phosphobaeteria YM3-2S and Phosphorus Dissolving Gene Cloning[D]. Ya’an: Sichuan Agriculture University, 2007. 赵珂. 溶磷菌YM3-2S溶磷特性及溶磷基因的克隆[D]. 雅安: 四川农业大学, 2007.

[12] Rodríguez H, Rossolini G M, Gonzalez T,etal. Isolation of a gene fromBurkholderiacepaciaIS-16 encoding a protein that facilitates phosphatase activity. Current Microbiology, 2000, 40(6): 362-366.

[13] Sajidan A, Farouk A, Greiner R,etal. Molecular and physiological characterisation of a 3-phytase from soil bacteriumKlebsiellasp. ASR1. Applied Microbiology & Biotechnology, 2004, 65: 110-118.

[14] Idriss E E, Makarewicz O, Farouk A,etal. Extracellular phytase activity ofBacillusamyloliquefaciensFZB45 contributes to its plant-growth-promoting effect. Microbiology, 2002, 148(7): 2097-2109.

[15] Yang M Y, Wang C H, Wu Z H,etal. Phosphorus dissolving capability, glucose dehydrogenase gene expression and activity of two phosphate solubilizing bacteria. Acta Microbiologica Sinica, 2016, 56(4): 651-663. 杨美英, 王春红, 武志海, 等. 不同条件下两株溶磷菌溶磷量及葡萄糖脱氢酶基因表达与酶活分析. 微生物学报, 2016, 56(4): 651-663.

[16] Grabherr M G, Haas B J, Yassour M,etal. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nature Biotechnology, 2011, 29(7): 644-652.

[17] Audic S, Claverie J M. The significance of digital gene expression profiles. Genome Research, 1997, 7(10): 986-995.

[18] Mortazavi A, Williams B A, Mccue K,etal. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods, 2008, 5(7): 621-628.

[19] Li X D, Shu J H, Yu E R,etal. Proteomic analysis of nitrogen stress responsive proteins in the leaves of tall fescue. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(3): 67-76. 李小冬, 舒健虹, 于二汝, 等. 高羊茅在低氮胁迫下的蛋白组学分析. 草业学报, 2016, 25(3): 67-76.

[20] Schenk P M, Carvalhais L C, Kazan K. Unraveling plant-microbe interactions: can multi-species transcriptomics help. Trends in Biotechnology, 2012, 30(3): 177-184. [21] Hu X F, Guo J Y, Zhang N,etal. Screening of a phosphate solubilizing and disease inhibiting bacteria strain and studies on its P-solubilizing characteristics. Scientia Agricultura Sinica, 2010, 43(11): 2253-2260. 胡晓峰, 郭晋云, 张楠, 等. 一株溶磷抑病细菌的筛选及其溶磷特性. 中国农业科学, 2010, 43(11): 2253-2260.

[22] Li L X. Effect of Dissolving Phosphorus Fungi on Soil Phosphorus Forms and Enzyme Activity and Rape Production in Reclamed Soil of Mining Area[D]. Taigu: Shanxi Agricultural University, 2014. 李林轩. 溶磷真菌对矿区复垦土壤磷形态、酶活性及油菜产量的影响[D]. 太谷: 山西农业大学, 2014.

[23] Chen K, Li J S, Yang H T,etal. Phosphate solubilizing abilities ofBacillusmegateriumstrain P1 and its fermentation conditions. Soil and Fertilizer Sciences in China, 2010, (4): 73-76. 陈凯, 李纪顺, 杨合同, 等. 巨大芽孢杆菌P1的解磷效果与发酵条件研究. 中国土壤与肥料, 2010, (4): 73-76.

[24] Yang H. Isolation, Identification of High-Effective Phosphate-Solubilizing Strains and Their Effects on Insoluble Phosphate Solubilization[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2007. 杨慧. 溶磷高效菌株筛选鉴定及其溶磷作用研究[D]. 北京: 中国农业科学院, 2007.

[25] Li X J, Wu F G, Wang B X,etal. The identification and application of a phosphorus-solubilizing bacteria in tabacco. Henan Agriculture Science, 2011, 40(6): 66-70. 李晓举, 吴风光, 王豹祥, 等. 一株烤烟根际解磷细菌的鉴定及其在烤烟生产中的应用. 河南农业科学, 2011, 40(6): 66-70.

[26] Lin K M, Guan X F, Ma L N,etal. Organophosphorus pesticide degrading bacteria-the biological characteristics ofEnterobacterclaocae. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2008, 24(9): 382-386. 林抗美, 官雪芳, 马丽娜, 等. 有机磷农药降解菌——阴沟肠杆菌的生物学特性. 中国农学通报, 2008, 24(9): 382-386.

[27] Illmer P, Barbato A, Schinner F. Solubilization of hardly-soluble AlPO4with P-solubilizing microorganisms. Soil Biology & Biochemistry, 1995, 27(3): 265-270.

[28] Patel D K, Archana G, Kumar G N. Variation in the nature of organic acid secretion and mineral phosphate solubilization byCitrobactersp. dhrss in the presence of different sugars. Current Microbiology, 2008, 56(2): 168-174.

[29] Gyaneshwar P, Kumar G N, Parekh L J,etal. Role of soil microorganisms in improving P nutrition of plants. Plant and Soil, 2002, 245: 83-93.

[30] Gyaneshwar P, Kumar G N, Parekh L J. Effect of buffering on the phosphate-solubilizing ability of microorganisms. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 1998, 14(5): 669-673.

[31] Prasanna N D, Vijayalakshmi K, Shaheen S K,etal. Screening and isolation of phosphate solubilizingPseudomonasstutzeri(EGB3) from gut of earthworm (Eiseniafoetida): solubilization as influenced by organic acids. Journal of Pure & Applied Microbiology, 2010, 4(2): 717-723.

Transcriptome profiling analysis of the phosphate-solubilizing mechanism of the white clover rhizosphere strain RW8

LI Xiao-Dong, WANG Xiao-Li, CHEN Xi, CAI Lu, ZENG Qing-Fei, SHU Jian-Hong, CAI Yi-Ming*

GuizhouAcademyofAgricultureScience,GuizhouInstituteofPrataculture,Guiyang550006,China

We conducted transcriptome sequencing of the white clover (Trifoliumrepens) rhizosphere phosphorus-solubilizing bacterium RW8 to explore its gene expression profiles. Cells of RW8 were cultured in three different media: one containing insoluble phosphorus (group A), one containing soluble phosphorus (group B), and one lacking phosphorus (group C). Compared with group B cells, group A cells showed 4782 and 447 up- and down-regulated genes, respectively, and group C cells showed 3630 and 209 up- and down-regulated genes, respectively. The up-regulated genes in Groups A and C had similar gene ontology annotations. The main subcategories in the biological process category were metabolic process, cellular process, single-organism process, response to stimulus, localization, and biological regulation. In the cell components category, the main subcategories were cell part, membrane, membrane part, and macromolecular complex. In the molecular function category, the main subcategories were catalytic, binding, and transporter. A metabolic pathway analysis showed that several metabolic pathways were significantly enriched in groups A and C, including 2-oxocarboxylic acid metabolism, alpha-linolenic acid metabolism, C5-branched dibasic acid metabolism, fatty acid metabolism, glycine-serine-threonine metabolism and valine-leucine-isoleucine biosynthesis. Ten differentially expressed genes in three different groups were analyzed by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). The transcriptional patterns detected by qRT-PCR were similar to those detected in the transcriptome sequencing analyses. The composition and concentrations of organic acids were detected by high performance liquid chromatography (HPLC). The lactic acid, succinic acid, and citric acid concentrations were significantly higher in group A and group C than in group B. The fumaric acid and malic acid concentrations were much higher in group C than in groups A and B, and did not differ significantly between groups A and B. The concentration of α-ketoglutaric acid was higher in group A than in group B, and did not differ significantly between groups C and B.

phosphorus-solubilizing bacteria; white clover; transcriptome profile; RW8; organic acid

10.11686/cyxb2016399

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-11-01；改回日期：2017-01-10

贵州省科技支撑项目(黔科合支撑[2016]2504号)和贵州省农科院专项基金(黔农科院院专项[2013]03)资助。

李小冬(1984-)，男，湖南邵阳人，副研究员，博士。 E-mail: lixiaodongzl@163.com*通信作者Corresponding author. E-mail: caiyiming2000@tom.com

李小冬, 王小利, 陈锡, 蔡璐, 曾庆飞, 舒健虹, 蔡一鸣. 转录组解析白三叶根际溶磷菌株RW8的解磷机制. 草业学报, 2017, 26(8): 168-179.

LI Xiao-Dong, WANG Xiao-Li, CHEN Xi, CAI Lu, ZENG Qing-Fei, SHU Jian-Hong, CAI Yi-Ming. Transcriptome profiling analysis of the phosphate-solubilizing mechanism of the white clover rhizosphere strain RW8. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(8): 168-179.