钙和钾对延胡索幼苗镉毒害的缓解作用

张静，余顺慧，祁俊生，梁克中，陈书鸿，刘雷，陈华华，陆亚萍

(重庆三峡学院三峡库区水环境演变与污染防治重庆高校市级重点实验室，重庆 404100)

钙和钾对延胡索幼苗镉毒害的缓解作用

张静，余顺慧，祁俊生*，梁克中，陈书鸿，刘雷，陈华华，陆亚萍

(重庆三峡学院三峡库区水环境演变与污染防治重庆高校市级重点实验室，重庆 404100)

通过探讨外源钙(Ca2+)、钾(K+)对重金属镉(Cd) (0～25 mg/kg)胁迫下延胡索幼苗的缓解作用，为延胡索经济高效优质高产的栽培模式提供理论依据和实践指导。以大叶延胡索为材料，采用土培法，研究外源Ca2+、K+处理对不同浓度Cd胁迫下延胡索幼苗株高、生物量、生理特征、重金属含量及药用品质的变化。结果表明，各浓度Cd胁迫下外源Ca2+、K+处理的最适缓解浓度分别为100和200 mg/kg，在该浓度下Ca2+、K+能明显缓解Cd对延胡索幼苗的抑制作用。在低浓度Cd胁迫下，添加最适浓度的外源Ca2+处理后幼苗可溶性糖、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性相比未添加外源Ca2+处理的对照组升高，而丙二醛(MDA)含量低于对照。添加最适浓度的外源K+处理后幼苗上述各指标无明显变化。高浓度Cd胁迫下，添加最适浓度的外源Ca2+处理后幼苗可溶性糖、SOD、POD和CAT活性显著高于对照，MDA含量显著降低。在各浓度Cd胁迫下，添加最适浓度的外源Ca2+、K+处理后幼苗根部细胞微核率降低，从而缓解了Cd对延胡索幼苗的毒害。因此，在Cd胁迫(尤其是25 mg/kg浓度Cd胁迫)下，外源Ca2+、K+通过提高延胡索幼苗的抗氧化能力来缓解Cd对幼苗毒害和细胞染色体损伤。此外，外源Ca2+、K+影响Cd胁迫下延胡索幼苗地上及地下部分Cd的积累，其影响机制比较复杂。25 mg/kg Cd胁迫下添加Ca2+能够显著改善延胡索的药用品质，延胡索乙素比25 mg/kg Cd胁迫下增加了27.52%。在Cd污染的土壤上种植延胡索，可加入适量的外源Ca2+通过改变延胡索幼苗的抗氧化酶活性等方式达到缓解Cd毒害，降低块茎中Cd含量，改善药用品质。

镉污染；延胡索；钙；钾；抗氧化酶；细胞微核率；品质

延胡索(Corydalisyanhusuo)为罂粟科紫堇属植物的干燥块茎，是常用的大宗药材之一，延胡索中的生物碱具有活血、镇痛、镇静、催眠、抗心律失常等功效[1]。镉(cadmium, Cd)主要来源于三废，是生物非必需金属元素，许多农田受其污染[2]。植物通过土壤吸收后不仅对植物产生一系列的毒害作用(抑制其他矿质元素的吸收、种子萌发[3]及根系生长等[4])，导致产量和品质下降[5-6]，还会通过食物链对人体健康造成威胁[7]。近来，“中药材中重金属、农残超标”屡见不鲜，这不仅影响药材的品质，威胁人类健康，更影响中药走向世界。

Ca2+、K+是植物必需的矿质营养元素，也是生长发育的调控者[8]。研究表明，施加外源Ca2+可以有效减少植物体内Cd的含量，缓解Cd对植物幼苗的伤害[9-12]。同时，施用钾肥明显降低了Cd的生物有效性，缓解Cd对植物幼苗的毒害作用[13-14]。药用植物受到Cd毒害后，是否可以通过施加外源物质来降低其重金属含量，提高药用安全性是值得研究的课题。本研究通过土培实验，以延胡索为材料，探讨了Ca2+、K+对Cd胁迫下延胡索幼苗生长、生理特性、药用品质及安全性的影响，以期通过人为调控方式科学施肥，为延胡索经济高效优质高产的栽培模式提供理论依据和实践指导。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验于2014年11月1日至2016年3月30日在重庆三峡学院野外科研基地进行。基地地处东经108°27′06″，北纬30°45′26″，属亚热带湿润型季风气候, 年均温13.8～18.8 ℃，年平均降雨量1000～1300 mm。供试土壤理化特性为pH值：6.30；有机质：18.35 g/kg；全氮：1.23 g/kg；水解氮：12.58 mg/kg；速效钾：50.34 mg/kg；速效磷：11.34 mg/kg；铅13.4 mg/kg；镉0.48 mg/kg。

1.2 试验材料

供试植物：大叶延胡索块茎于2014年10月购于浙江省东阳市农业局。

1.3 试验设计

外源Ca2+和K+对不同浓度Cd胁迫下延胡索幼苗生长的影响试验，Cd [Cd(NO3)2形式]设6个处理浓度，分别为：0、1、3、10、20、25 mg/kg，每个处理5盆。在上述Cd处理中分别加入外源Ca2+(CaCl2形式)，处理浓度为：0、50、100、200、400 mg/kg；外源K+(K2SO4形式)处理浓度为：0、100、200、400、800 mg/kg。从2014年11月1日起，持续处理150 d。通过不同浓度外源Ca2+、K+对不同浓度Cd胁迫下延胡索幼苗生长的影响得到不同浓度Cd胁迫下的最适外源Ca2+、K+浓度，然后用最适的外源Ca2+、K+浓度进行缓解实验。

缓解试验设3个处理：1)对照：Cd处理浓度为：0、1、3、10、20、25 mg/kg；2)系列 Cd处理+最适外源Ca2+处理；3)系列Cd处理+最适外源K+处理。试验采用内径30 cm、深25 cm的花盆，土样过5 mm筛后，每盆装拌有对应Cd和钙、钾肥的土壤9 kg，放置半个月后再次混匀。将消毒处理的延胡索块茎播种于上述对应花盆中，每盆5粒，同时施加适量的基肥(尿素浓度为N 300 mg/kg)。试验所用的肥料、药品均为分析纯。定期检查生长情况，用蒸馏水浇灌，常规人工管理，避免其余干扰，环境条件完全一致。从2015年11月1日起，持续处理150 d。

1.4 测定指标及方法

取处理150 d后5盆延胡索植株，用尺子测量每株幼苗的株高。用烘干称重法测定生物量，具体如下：取5盆延胡索清除根系周围的泥土，自来水洗净，再用去离子水冲洗，用吸水纸吸干水分后105 ℃杀青20 min，45 ℃烘干至恒重。选取延胡索幼苗成熟功能叶片5片，SOD、POD和CAT活性采用试剂盒测定(南京建成生物工程研究所)；MDA、可溶性糖测定分别采用硫代巴比妥酸比色法和蒽酮法[15]；微核率测定采用修正的吴若菁等[16]的方法，具体如下：分别于Cd胁迫以及加入外源Ca2+、K+缓解处理150 d后，取5盆延胡索清除根系周围的泥土，去离子水洗净，吸去多余水分后，切取长度为5 mm根尖制片镜检，根尖用改良Carnoy固定液固定20～24 h，转移至70%乙醇中于0～4 ℃下保存，加入1 mol/L盐酸在60 ℃水浴下离解8～10 min直至根尖软化，避光条件用改性石碳酸品红浸泡染色2～3 h，用乙醇和蒸馏水漂洗后制片镜检观察微核，计算微核率。

微波消解测定Cd含量，具体如下：精确称取延胡索粉末(过0.355 mm筛)0.2000 g，加入酸液(浓HNO3∶浓H2SO4=4∶1)，同时做空白；经MARS240微波消解后，冷却、过滤、定容，用原子吸收分光光度计(AA-6300，日本岛津集团)[17]测定。延胡索块茎生物碱类含量的测定采用张静等[18]的方法，具体如下：精确称取延胡索粉末(过0.355 mm筛)0.5000 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加70%甲醇溶液10 mL，混匀，浸泡1 h，30 ℃下超声(300 W，40 kHz)提取40 min，放至室温，过滤，用70%甲醇定容至25 mL量瓶中，摇匀后0.45 μm微孔滤膜过滤，即得，用LC-20A型高效液相色谱仪(日本岛津集团)在文献[18]色谱条件下测定其生物碱类含量，5次重复。

1.5 数据分析

各指标均重复3次所得。用Microsoft Excel 2007、IBM SPSS Statistic 20软件进行数据处理。采用单因素方差分析方法(One-way ANOVA)检验各处理间的差异显著性(其中P<0.01表示差异极显著,P<0.05表示差异显著)。

2 结果与分析

2.1 外源Ca2+和K+对不同浓度Cd胁迫下延胡索幼苗生长的影响

由图1可见，在不同浓度Cd处理下，延胡索株高及生物量均随外源Ca2+和K+含量增加而先增高后降低，且在Ca2+浓度为100 mg/kg和K+浓度为200 mg/kg时株高和生物量最大，因此，将该浓度确定为Ca2+、K+对延胡索Cd胁迫的最佳缓解浓度，表现为外源Ca2+、K+对延胡索生长有一定促进作用。

2.2 外源Ca2+和K+对不同浓度Cd胁迫下延胡索幼苗可溶性糖、丙二醛和抗氧化酶活性的影响

由图2可见，在未添加Ca2+、K+时，随着Cd浓度的增加，延胡索叶片可溶性糖含量、CAT活性及POD活性出现先增大后减小的趋势(Cd浓度为10 mg/kg时最大)，MDA含量呈现上升趋势，而SOD活性呈现下降趋势。添加Ca2+和K+时在浓度25 mg/kg Cd处理下，外源Ca2+使叶片可溶性糖含量、SOD活性、CAT活性及POD活性显著增加(P<0.05)，MDA含量显著降低(P<0.05)，较同浓度Cd胁迫下降低了56.17%， 外源K+对上述指标影响差异不显著。这表明在浓度25 mg/kg Cd处理时，外源Ca2+缓解延胡索受Cd胁迫造成氧化伤害是通过提高SOD、POD及CAT 活性来实现的。其他各浓度Cd处理下，外源Ca2+、K+对延胡索叶片内可溶性糖含量、MDA含量、CAT活性、SOD活性及POD活性均无显著影响。

图1 Cd胁迫下外源Ca2+和K+对延胡索幼苗株高、生物量的影响Fig.1 Effect of exogenous Ca2+ and K+ on the plant height and biomass of the C. yanhusuo seedlings under Cd stress

图2 Cd胁迫下外源Ca2+和K+对延胡索幼苗可溶性糖、MDA、SOD活性、CAT活性、POD活性的影响Fig.2 Effect of exogenous Ca2+ and K+ on the soluble sugar, MDA content, SOD activity, CAT activity and POD activity of the C. yanhusuo seedlings under Cd stress 不同小写字母表示在同一镉胁迫浓度不同处理间存在P<0.05水平的显著差异，下同。Vertical bars followed by the different small letters are significantly different at P<0.05 among different treatments at the same Cd stress concentration. The same below.

图3 Cd胁迫下外源Ca2+和K+处理对延胡索幼苗微核率的影响Fig.3 Effect of exogenous Ca2+ and K+ on the micronucleus rate of the C. yanhusuo seedlings under Cd stress

2.3 外源Ca2+和K+对同浓度Cd胁迫下延胡索幼苗根部细胞微核率的影响

由图3可见，在不用外源Ca2+和K+处理时，随着Cd胁迫浓度的增大，幼苗根部细胞微核率逐渐增加。这说明在重金属Cd胁迫作用下，随Cd浓度的升高，延胡索幼苗根部细胞产生的染色体断裂增多，导致细胞内微核率大幅度增加。在各浓度Cd胁迫下，添加外源Ca2+和K+处理可使幼苗根部细胞微核率显著降低(P<0.05)。在同一浓度Cd胁迫下，添加外源 Ca2+比添加外源K+处理使得延胡索幼苗根部细胞中微核率降低得更多，缓解作用更强。

2.4 外源Ca2+和K+对不同浓度Cd胁迫下延胡索镉积累的影响

图4表明，在Cd处理下延胡索幼苗地上及地下部分Cd含量显著增加，添加最适浓度外源Ca2+和K+后，延胡索幼苗地上部分及地下部分Cd含量的差异较大。其中在Cd处理下施加最适浓度外源Ca2+后延胡索地上部分Cd含量显著增加(P<0.05)，施加K+后延胡索地上部分Cd含量显著降低(P<0.05)；地下部分情况相反，外源Ca2+处理使得延胡索Cd含量显著降低(P<0.05)，外源K+处理使得延胡索Cd含量显著增加(P<0.05)。

图4 Cd胁迫下外源Ca2+和K+处理对延胡索幼苗地上、地下部分Cd积累的影响Fig.4 Effect of exogenous Ca2+ and K+ on the Cd content of the C. yanhusuo seedlings under Cd stress

表1 Cd胁迫下外源Ca2+和K+对延胡索6种生物碱的影响

不同小写字母表示各处理间差异显著(P<0.05)。Different letters indicate significant differences (P<0.05) among different treatments.

2.5 外源Ca2+和K+对Cd胁迫下延胡索药用品质的影响

由表1可见，与CK (无Cd、Ca2+和K+处理)相比，在Cd浓度25 mg/kg胁迫下，可显著降低延胡索乙素的含量(P<0.05)。添加Ca2+和K+后与单一Cd胁迫(浓度25 mg/kg)相比，延胡索乙素显著增加(P<0.05)，且添加Ca2+，6种生物碱增加量整体上大于添加K+。

3 讨论

本研究中，在各浓度Cd胁迫时，添加外源Ca2+和K+在一定程度上都能促进延胡索幼苗生长，但外源Ca2+和K+处理对Cd胁迫的缓解作用存在最适浓度效应。添加了最适浓度的外源Ca2+和K+后与受到单一Cd胁迫的对照相比，能明显缓解Cd胁迫对幼苗生长的抑制作用，增加幼苗的耐Cd性。这与汪骢跃等[14]的研究结果一致。

SOD酶通过清除细胞中的O2-·防止生物膜脂质过氧化，对生物膜起保护作用[19]。本研究中，外源Ca2+与25 mg/kg Cd组合与只添加25 mg/kg Cd相比显著提高延胡索幼苗的SOD活性，表明在此浓度Cd胁迫时，Ca2+处理使延胡索幼苗减轻Cd胁迫造成的氧化损伤可能通过提高SOD活性来完成。外源K+与此浓度Cd组合导致幼苗可溶性糖含量及SOD活性与只添加25 mg/kg Cd相比无显著变化，表明K+处理对延胡索SOD活性无显著影响。POD酶同样是植物体内的抗氧化酶。本研究中，在低浓度Cd(<25 mg/kg)胁迫下外源Ca2+和K+使得延胡索幼苗POD活性略微增加(与只添加对应浓度Cd处理相比),无显著变化，外源Ca2+与25 mg/kg Cd组合与单一添加25 mg/kg Cd相比显著提高延胡索幼苗的POD活性，这表明在浓度25 mg/kg Cd胁迫下，外源Ca2+处理使延胡索幼苗通过提高POD活性来完成减轻Cd胁迫造成的氧化损伤。CAT酶也具有防止膜氧伤害的作用，其可以与SOD酶共同作用将H2O2分解为O2和H2O。本研究发现CAT活性也与SOD、POD酶一样，在Cd浓度25 mg/kg胁迫下，延胡索幼苗通过外源Ca2+提高CAT活性以降低Cd胁迫引起的氧伤害。MDA是植物膜脂过氧化作用的最终产物之一，作为植物膜系统受伤害的重要指标。其含量越高，植物细胞膜受伤害程度越大；反之亦然[20]。本研究中，延胡索幼苗在25 mg/kg Cd处理下添加外源Ca2+后的MDA含量与对照相比显著下降, 膜脂过氧化得到缓解。而在低浓度Cd(<25 mg/kg)胁迫添加Ca2+和各浓度Cd胁迫下添加外源K+后的MDA含量变化不显著，不能缓解膜脂过氧化。这与朱涵毅等[21]的研究结果一致，可能是由于Cd直接取代了抗氧化酶活性中心的金属元素，导致酶活性受到抑制，进一步造成延胡索抗氧化系统损伤，自由基的清除能力降低[22]。

Cd胁迫能够诱发植物根尖细胞加速老化，使核仁受损，从而破坏基因组模板的稳定性，并使DNA合成受阻[23]。研究表明，Cd胁迫诱导蚕豆(Viciafaba)叶片细胞产生染色体端部断裂，进而形成后期桥和断片，有的则产生落后染色体，染色体断片和落后染色体进一步形成微核[24]。本研究中，在各浓度Cd胁迫下，添加外源Ca2+、K+后延胡索幼苗微核率与对应各浓度Cd胁迫相比显著降低，对Cd胁迫引起的染色体结构损伤起缓解作用。

研究表明，降低作物对Cd吸收与积累主要途经是利用化学调控手段缓解Cd毒害[21]。Ca2+与Cd的化学性质相近，是土壤中Cd吸附位点的主要竞争者，因此Ca2+能够显著减弱土壤对Cd的吸附[25]。同时Ca2+还参与植物蛋白质的合成，维持细胞渗透压，也是植物必须营养元素。Ca2+通过降低动植物对镉的吸收，以达到缓解毒害的效果[26]。其中，施加Ca2+处理能够缓解Cd胁迫下花生对重金属的吸收与转移，缓解Cd的毒害，同时Ca2+处理也使得花生中Cd的积累变化较大[27]。本研究中，添加外源Ca2+对延胡索影响与前人[27]的研究一致，降低了地下部分Cd的积累，这有利于控制延胡索块茎中Cd的含量。钾肥伴随阴离子影响重金属形态、吸附解吸过程及生物有效性等，完成对土壤中重金属的影响，从而减少植物对Cd的吸收。K+处理后，使植物地下部对Cd的吸收量随着K+施加量的增加而减少，钾浓度为100 mg/kg 时，Cd含量最小，而地上部分，Cd含量随着K+施加量的增加而增大[4]。本研究施加外源K+后，地上部分Cd含量降低，地下部分的Cd含量增加，K+缓解了地上部分的Cd毒害，这可能是由于延胡索根系吸收钾、镉的方式不同，K+相比二价离子竞争植物根系的吸收位点的能力较弱[28]。另一方面，土壤中的钾促进镉的解吸，增加了土壤溶液中Cd的含量[29]。因此，施用钾肥明显提高延胡索根际对镉的吸收，与前人的研究结果一致[30]。

本研究中，Cd胁迫能明显抑制延胡索生物碱类化合物的合成。其中延胡索乙素的含量是反映延胡索药用品质的主要指标，也是中国药典控制的指标之一[31-32]。25 mg/kg Cd胁迫下导致延胡索幼苗中可溶性糖含量、抗氧化酶活性等降低，这可能进一步影响延胡索苄基异喹啉型生物碱的合成。另外，在Cd胁迫基础上增施Ca2+、K+后显著提高了延胡索生物碱类化合物特别是延胡索乙素的合成，改善了品质。这可能是由于Ca2+、K+可以改善光合作用、促进营养吸收[33]。但Cd胁迫下添加Ca2+、K+后Cd在延胡索中的转移机制尚不清楚，还有待于进一步研究。

4 结论

1)添加外源Ca2+、K+能够在一定程度上有效缓解Cd对延胡索幼苗的毒害效应，且外源Ca2+比K+处理效果更好。2)外源Ca2+处理可提高叶片中可溶性糖含量及降低MDA含量来缓解Cd对延胡索幼苗的毒害效应。此外外源Ca2+可提高幼苗SOD、CAT、POD活性，使Cd处理所造成的氧化胁迫降低，膜脂过氧化伤害得到缓解。3)添加外源Ca2+、K+处理均能使延胡索幼苗根部细胞微核率显著降低。相同浓度Cd胁迫下，添加外源Ca2+比外源K+处理使得延胡索幼苗根部细胞中微核率降低得更多。4)Ca2+、K+的施加改变了延胡索幼苗地上地下部分Cd的含量，这对延胡索安全性的控制有一定的指导意义，而且Ca2+、K+在一定程度上都能改善延胡索的药用品质，且Ca2+处理的效果更好。

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Alleviation of cadmium toxicity inCorydalisyanhusuoseedlings by exogenous calcium or potassium

ZHANG Jing, YU Shun-Hui, QI Jun-Sheng*, LIANG Ke-Zhong, CHEN Shu-Hong, LIU Lei, CHEN Hua-Hua, LU Ya-Ping

KeyLaboratoryofWaterEnvironmentEvolutionandPollutionControlinThreeGorgesReservoir,ChongqingThreeGorgesUniversity,Chongqing404100,China

In this study, we explored the alleviating effects of exogenous calcium (Ca2+) and potassium (K+) onCorydalisyanhusuoseedlings under cadmium (Cd) stress. Seedlings ofC.yanhusuowere grown in soil containing Cd (0-25 mg/kg) and their plant height, biomass and physiological characteristics, heavy metal content, and medicinal quality were determined. At all levels of Cd stress, the optimal concentrations of exogenous Ca2+and K+to alleviate Cd stress were 100 and 200 mg/kg, respectively. Under low-Cd and high-Cd stress, the addition of 100 mg/kg Ca2+increased the soluble sugars content in seedlings, increased the activities of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) and catalase (CAT), and decreased the malondialdehyde (MDA) content, compared with those in plants without exogenous Ca2+treatment. There were no changes in these parameters in plants under low-Cd stress treated with K+at 200 mg/kg. Under all levels of Cd stress, the addition exogenous Ca2+and K+at the optimal concentrations decreased the rate of micronucleus formation in the roots, indicating that there was a significant alleviation of Cd poisoning. Under Cd stress (especially high-Cd stress at 25 mg/kg), exogenous Ca2+and K+alleviated Cd poisoning of seedlings and relieved chromosomal damage by increasing the antioxidant capacity ofC.yanhusuoseedlings. Exogenous Ca2+and K+also affected Cd accumulation in above-ground and below-ground parts of the plant, but the effects were complex. Under 25 mg/kg Cd stress, the tetrahydropalmatine content increased by 27.52% after adding exogenous Ca2+, indicating a significant increase in the medicinal quality ofC.yanhusuo. Therefore, when growingC.yanhusuoin soil contaminated with Cd, the addition of an appropriate amount of Ca2+can alleviate Cd poisoning via its effects on the activity of antioxidant enzymes. This leads to a decrease in the Cd content in tubers, thereby improving their medicinal quality. These results provide a theoretical basis for the safe and efficient cultivation of high-qualityC.yanhusuoin Cd-contaminated soil.

Cd contamination;Corydalisyanhusuo; calcium (Ca); potassium (K); antioxidant enzymes; micronucleus frequency; quality

10.11686/cyxb2016386

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-10-13；改回日期：2016-12-26

重庆市应用开发计划项目(cstc2014yykfA110024)和三峡库区水环境演变与污染防治重点实验室项目(WEPKL2012MS-01)资助。

张静(1992-)，男，重庆万州人，在读硕士。E-mail: 435280513@qq.com*通信作者Corresponding author. E-mail: 1208986565@qq.com

张静, 余顺慧, 祁俊生, 梁克中, 陈书鸿, 刘雷, 陈华华, 陆亚萍. 钙和钾对延胡索幼苗镉毒害的缓解作用. 草业学报, 2017, 26(8): 123-130.

ZHANG Jing, YU Shun-Hui, QI Jun-Sheng, LIANG Ke-Zhong, CHEN Shu-Hong, LIU Lei, CHEN Hua-Hua, LU Ya-Ping. Alleviation of cadmium toxicity inCorydalisyanhusuoseedlings by exogenous calcium or potassium. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(8): 123-130.