人参茎叶总皂苷对小菜蛾取食、解毒酶及乙酰胆碱酯酶的影响1)

奚广生

(吉林农业科技学院，吉林省·吉林市，132101)

王二欢 杨鹤

(吉林农业大学)

人参茎叶总皂苷对小菜蛾取食、解毒酶及乙酰胆碱酯酶的影响1)

奚广生

(吉林农业科技学院，吉林省·吉林市，132101)

王二欢 杨鹤

(吉林农业大学)

以人参(Panax ginsengC.A.Mey)茎叶总皂苷为试验材料，以小菜蛾(Plutella xylostella (L.))为试验昆虫，测定小菜蛾取食、解毒酶及乙酰胆碱酯酶活性。结果表明：人参茎叶总皂苷对小菜蛾取食有明显抑制作用；低质量浓度人参茎叶总皂苷能够激活小菜蛾体内多功能氧化酶系(MFO)活性，而高质量浓度人参茎叶总皂苷对小菜蛾体内多功能氧化酶系(MFO)活性具有抑制作用；人参茎叶总皂苷，能够抑制谷胱甘肽-S-转移酶及羧酸酯酶活性；低质量浓度时人参茎叶总皂苷对小菜蛾体内乙酰胆碱酯酶活性影响不大，中质量浓度能够抑制小菜蛾体内乙酰胆碱酯酶活性，而高质量浓度时抑制作用与中质量浓度相比有所减弱。

人参；人参皂苷；小菜蛾

人参(PanaxginsengC.A.Mey)是我国极具有优势和特色的药用作物，其用药历史悠久[1]。近年来研究发现，人参皂苷是人参的主要药效成分[2]，也是人参体内主要的化感物质，能够在一定程度上阐述人参连作障碍产生的原因。为了合理利用药用植物人参，早在上世纪70年代人们针对人参茎叶化学成分进行了一系列研究。2015年版《中国药典》[3]将人参茎叶收载，由于其含有人参皂苷且生理活性明显，是国内外研究的热点，目前人参茎叶总皂苷(GSLS)已成为应用最为广泛的人参提取物之一。野生人参寿命长，且生长环境恶劣，但其极少受到虫害的影响。研究发现，人参总皂苷能够延长粘虫生育历期；对苜蓿夜蛾幼虫及粘虫取食具有显著性抑制作用，拒食效果随浓度的升高而增大，且对其体内蛋白质含量、消化酶活性、保护酶活性具有较大影响[4-7]；能够改善线虫的生存状态及延长其寿命，促进线虫发育，增强其运动和抗热激能力[8]。据此，本研究以田间常见昆虫小菜蛾(PlutellaxylostellaL.)为试验昆虫，从小菜蛾趋避作用、解毒酶活性及神经系统酶活性三方面对人参皂苷生物活性进行研究，探讨人参茎叶总皂苷的生态学作用，旨在为研究人参皂苷在人参环境适应中的作用及其机制提供参考。

1 材料与方法

人参茎叶总皂苷溶液的配制：人参茎叶总皂苷(纯度80%)由吉林大学药学院提供，使用时用0.1%曲拉通溶液分别配制成低质量浓度(5 g/L)、中质量浓度(10 g/L)和高质量浓度(20 g/L)的质量浓度梯度，现配现用。

供试昆虫小菜蛾：2龄小菜蛾由中国农业科学院植物保护研究所提供，带回吉林农业科技学院中药学院实验室，在温度(27±1)℃、相对湿度40%、光照80%、光周期12 h/12 h(光/暗)的人工气候培养箱内，用新鲜无农药无病虫害的油菜叶片词养备用。

供试植物油菜叶片(未喷洒过农药)：采自吉林农业科技学院中药学院药用植物种源圃。

趋避试验：将新鲜油菜叶片以中脉为分界线，一边为处理，一边为对照；用毛笔沾取现配好的不同质量浓度梯度的人参皂苷溶液均匀涂抹在叶片处理一侧为处理组，涂抹蒸馏水组为对照组，自然晾干。将涂抹药液晾干后的叶片放到衬有湿滤纸的培养皿中，每皿1片；向处理一侧接2龄小菜蛾10头，用保鲜膜封住皿口，再用解剖针在保鲜膜上扎若干小孔，室温饲养。0、12、24、36、48、60 h统计处理一侧小菜蛾数目，并计算趋避率。趋避率=((对照组处理侧小菜蛾数量-处理组处理侧小菜蛾数量)/对照组处理侧小菜蛾数量)×100%。

试虫处理：釆用载毒叶碟法[9](略有改动)。挑选生长健康的2龄小菜蛾饥饿处理6 h；将新鲜油菜叶片在不同质量浓度梯度的人参皂苷溶液中浸泡3 s，挥干表面水分，放入衬有湿滤纸的培养皿中；将经过饥饿处理后的2龄小菜蛾放入培养皿中(30头/皿)，保鲜膜封住皿口，并用解剖针在保鲜膜面扎若干小孔，室温喂养；每个处理3个重复，同时用蒸馏水做空白对照组。在24、48 h时进行多功能氧化酶系(MFO)、羧酸酯酶酶活、谷胱甘肽转移酶酶活、乙酰胆碱酯酶酶活及蛋白质含量测定。

酶源的制备：取试虫10头移入预冷的玻璃匀浆器中，加入1 mL浓度为0.1 mol/L、pH=7.4的PBS(每升含EDTA、DTT、PTU、PMSF各1 mmol，每升含甘油100 g)在冰浴中充分研磨匀浆，并补足体积到2 mL；匀浆液置于4 ℃、12 000 r/min离心15 min，上清液分装于离心管中；-20 ℃冷冻，分别用于蛋白质总含量和多功能氧化酶系(MFO)、羧酸酯酶、谷胱甘肽转移酶、乙酰胆碱酯酶酶活测定。

蛋白含量测定：以牛血清白蛋白做标准曲线；将酶液作为反应液，用于蛋白质含量的测定。加入考马斯亮蓝试剂，混匀，室内放置5 min，用酶标仪595 nm处测定OD值，并计算蛋白质含量[10]。

多功能氧化酶系(MFO)活性测定：根据Hansen et al.[11]方法。将室温调至27 ℃，在96孔酶标板中，每孔依次加入100 μL浓度为2 mmol/L的P-NA，90 μL酶源，最后加入10 μL浓度为8 mmol/L的NADPH。立即放入酶标仪下，测定405 nm下的OD值，测定时间30 min，每1 min取值1次，以每分钟OD405变化0.1为一个酶活单位U，酶活单位为U/(mg·min)。

谷胱甘肽-S-转移酶活性测定：根据Habig[12]方法，在离心管中依次加入1.2 mL浓度为66 mmol/L的pH=7.4的PBS(含EDTA 2 mmol/L)、0.15 mL浓度为50 mmol/L的还原型谷胱甘肽、0.05 mL浓度为0.03 mol/L的CDNB、0.1 mL酶液，以磷酸缓冲液为对照。摇匀立即放入酶标仪下，测定340 nm下的OD值，测定时间5 min，每1 min取值一次。以每分钟OD340变化0.1为一个酶活单位U，酶活单位为U/(mg·min)。

羧酸酯酶活性测定：参照Van Aperen[13]方法，在离心管中依次加入1.43 mL浓度为0.3 mmol/L底物(浓度为0.04 mol/L、pH=7.0的PBS(含有体积比1%浓度为0.03 mol/L的α-醋酸萘酯、体积比1%浓度为0.1 mmol/L的毒扁豆碱))、285 μL酶液。放入摇床中30 ℃震荡30 min，立即加入285 μL显色液(质量分数为1%的固兰B盐和质量分数为5%的十二烷基硫酸钠，使用前以V(固兰B盐)∶V(十二烷基硫酸钠)=2∶5混合)。稳定0.5 h后，吸取250 μL注入96孔酶标板中，测定600 nm下的OD值，以单位时间内单位蛋白催化生成a-奈酚的量为酶活单位，即nmoL/(mg·min)。

乙酰胆碱酯酶活性测定：采用Ellman et al.[14]方法(有改动)，在离心管中依次加入测定液(测定管中为酶液，对照管中为酶提取液)1.3 mL，再加入50 μL底物显色剂混合液[浓度为0.075 mol/L的碘化硫代乙酰胆碱和浓度为0.01 mol/L的二硫硝基苯甲酸液(含质量分数为1.8%的碳酸氢钠)，使用前以V(碘化硫代乙酰胆碱)∶V(二硫硝基苯甲酸液)=1∶2混合]。27 ℃震荡15 min，加入250 μL反应终止液(浓度为1 mmol/L的毒扁碱)；吸取250 μL注入96孔酶标板中，测定412 nm下的OD值。与对照管相比，以每分钟OD412变化0.1为一个酶活单位U，酶活单位为U/(mg·min)。

数据处理：采用Gen5进行数据导出，运用office Excel 2010进行数据筛选及初步计算酶活降，DPS7.05对数据进行统计分析。酶活降=24 h酶活力-48 h酶活力。

2 结果与分析

2.1 人参茎叶总皂苷对小菜蛾趋避作用的影响

由表1可见：人参茎叶总皂苷对小菜蛾取食存在趋避作用。趋避率随人参茎叶总皂苷质量浓度的增加而增大，随处理时间的延长而降低。处理24 h时，人参茎叶总皂苷对小菜蛾拒食率达85%以上；处理48 h后，其拒食率有所下降，在40%～56%之间。

表1 人参茎叶总皂苷质量浓度和处理时间不同时小菜蛾取食的趋避率(n=5)

人参茎叶总皂苷质量浓度/g·L-1趋避率/%处理24h处理48h585.710±2.47441.270±1.3751091.670±1.44349.210±1.3742092.590±0.06455.160±2.090

注：表中趋避率的数据为“平均值±标准差”。

2.2 人参茎叶总皂苷对小菜蛾多功能氧化酶系(MFO)活性的影响

由表2可见：人参茎叶总皂苷低质量浓度(5 g/L)能促进MFO活性，而中、高质量浓度(10、20 g/L)抑制MFO活性，且随质量浓度的增加MFO酶活降低。随处理时间的增加，MFO活性降低，且低质量浓度酶活降高于对照组，中高质量浓度组随质量浓度的增加酶活降降低，且低于对照组。

表2 人参茎叶总皂苷质量浓度和处理时间不同时小菜蛾体内MFO活性

人参茎叶总皂苷质量浓度/g·L-1MFO活性/U·mg-1·min-1处理24h处理48hMFO酶活降/U·mg-1·min-1CK(2.770±0.688)ab(2.56±0.579)ab0.215(4.130±0.592)a(3.67±1.126)a0.4610(2.440±0.420)bc(1.90±0.274)bc0.5420(1.450±0.714)c(1.12±0.733)c0.33

注：表中MFO活性数据为“平均值±标准差”；同列数据后不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.3 人参茎叶总皂苷对小菜蛾谷胱甘肽-S-转移酶活性的影响

由表3可见：随人参茎叶总皂苷质量浓度的增加，谷胱甘肽-S-转移酶活性与对照组相比明显降低，且呈现先降低后升高趋势；随处理时间的延长，其酶活性明显降低，处理组酶活降明显低于对照组，并随人参茎叶总皂苷质量浓度的增加呈先降低后增高趋势。当人参茎叶总皂苷质量浓度为10 g/L时，其酶活性及酶活降最低；处理时间延长至48 h时，高质量浓度(20 g/L)人参茎叶总皂苷处理与对照组酶活性无差异。

表3 人参茎叶总皂苷质量浓度和处理时间不同时小菜蛾体内谷胱甘肽-S-转移酶活性

人参茎叶总皂苷质量浓度/g·L-1谷胱甘肽-S-转移酶活性/U·mg-1·min-1处理24h处理48h谷胱甘肽-S-转移酶活降/U·mg-1·min-1CK(1742.680±70.589)a (1084.560±86.917)a658.115(1325.520±124.666)b(865.530±67.757)bc459.9910(907.090±66.000)c(774.240±61.018)c132.8520(1574.830±84.381)a(1001.190±96.023)ab573.64

注：表中谷胱甘肽-S-转移酶活性数据为“平均值±标准差”；同列数据后不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.4 人参茎叶总皂苷对小菜蛾羧酸酯酶活性的影响

由表4可见：人参茎叶总皂苷对小菜蛾羧酸酯酶活性有一定抑制作用。用质量浓度5 g/L溶液处理24 h，其酶活性与对照相比无差异；随处理液质量浓度的增加，其酶活呈先降低后升高趋势，质量浓度在10 g/L时酶活性最低。处理组随处理时间的增加，酶活性降低，且酶活降随处理液质量浓度的增加而减小；质量浓度5 g/L人参茎叶总皂苷处理比对照组能明显增加酶活降，而其余处理组与对照组相比酶活降减小。

2.5 人参茎叶总皂苷对小菜蛾神经系统-乙酰胆碱酯酶活性的影响

由表5可见：人参茎叶总皂苷对小菜蛾体内乙酰胆碱酯酶活性有一定影响。人参茎叶总皂苷处理24 h，与对照组相比，质量浓度为5 g/L处理组对小菜蛾体内乙酰胆碱酯酶活性无影响，但质量浓度为10、20 g/L处理组与对照相比酶活显著性降低，且质量浓度为10 g/L处理组酶活性最低。人参茎叶总皂苷处理48 h，各组酶活性均有所降低，对照组酶活与处理组无差异，但质量浓度为20 g/L处理，酶活性显著性高于质量浓度为5、10 g/L处理；与对照组相比，质量浓度为5 g/L处理酶活降略有升高但差异不大，而质量浓度为10、20 g/L处理酶活降显著降低，且质量浓度为20 g/L处理低于质量浓度为10 g/L的处理。

表4 人参茎叶总皂苷质量浓度和处理时间不同时小菜蛾羧酸酯酶活性

人参茎叶总皂苷质量浓度/g·L-1羧酸酯酶活性/nmol·mg-1·min-1处理24h处理48h羧酸酯酶活性酶活降性/nmol·mg-1·min-1CK(1.370±0.082)a(1.070±0.070)a0.305(1.270±0.059)ab(0.750±0.070)b0.4610(0.850±0.061)c(0.450±0.040)c0.2820(1.080±0.046)b(0.920±0.048)a0.17

注：表中羧酸酯酶活性数据为“平均值±标准差”；同列数据后不同字母表示差异显著(P<0.05)。

表5 人参茎叶总皂苷质量浓度和处理时间不同时小菜蛾乙酰胆碱酯酶活性

人参茎叶总皂苷质量浓度/g·L-1乙酰胆碱酯酶活性/U·mg-1·min-1处理24h处理48h乙酰胆碱酯酶活降/U·mg-1·min-1CK(5.730±0.536)a(2.020±0.416)ab3.715(5.650±0.634)a(1.680±0.228)b3.9710(3.300±0.345)b(1.280±0.145)b2.1420(4.410±0.562)b(2.330±0.201)a1.97

注：表中羧酸酯酶活性数据为“平均值±标准差”；同列数据后不同字母表示差异显著(P<0.05)。

3 结论与讨论

在植物的进化历程中，植物次生代谢产物是植物响应环境变化所产生的一类重要物质，其能够抵御病虫草害，从而使植物在竞争中处于有利地位。

植物次生代谢产物对部分植食性昆虫具有趋避、拒食和毒杀作用。已有研究发现，人参皂苷对苜蓿夜蛾幼虫及粘虫取食具有显著性抑制作用；植物凝集素对甜菜夜蛾、马铃薯叶甲、萝卜蚜、棉铃虫、烟叶甲等植食性昆虫具有忌避、拒食活性[15]；华北白前提取物，对斜纹夜蛾3龄和5龄幼虫均有较好的拒食活性[16]；垂序商陆全草、博落回、柚皮粗提物，抑制松梢螟幼虫的取食[17-18]；马桑倍半萜内酯成分中的羟基马桑毒素、马桑亭、马桑宁，对粘虫都具有不同程度的触杀作用，其中羟基马桑毒素的触杀作用最强[19]；蜈蚣草三氯甲烷萃取物，对莴苣指管蚜、斜纹夜蛾具有较高的杀虫活性[20]。

本研究测定了人参茎叶总皂苷对小菜蛾取食的影响，结果表明：人参茎叶总皂苷对小菜蛾有明显趋避作用，趋避率随处理液质量浓度的增加而增大，随处理时间的延长而降低。原因：一是小菜蛾取食带有人参茎叶总皂苷的油菜叶片后，其体内产生了能够降解或转化人参茎叶总皂苷的酶；二是油菜表面具有吸收并转化人参茎叶总皂苷酶类。因此，应深入研究小菜蛾取食含有人参茎叶总皂苷的油菜叶片后其体内化学物质，及浸泡人参茎叶总皂苷后油菜叶片生理生化变化及化学成分变化。

多功能氧化酶系(MFO)、羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶，均是昆虫体内重要的解毒酶，其活力大小决定昆虫解毒能力的强弱，是昆虫产生抗药性的重要机制。抑制其活性，能降低解毒能力，延长外源物质在昆虫体内的作用时间，提高昆虫死亡率。部分植物提取物，能有效抑制其活性，而且随植物提取物浓度的增加抑制作用增强。这在生产上具有重要意义，说明植物源物质与其它杀虫剂复配发挥其增效作用是未来农药的发展方向。众多研究表明，人参皂苷具有抗氧化作用。本研究结果显示：低质量浓度组能够激发MFO活性，而中高质量浓度组能够抑制MFO活性，且随质量浓度的增高抑制效果增强，说明低质量浓度人参茎叶总皂苷能激发小菜蛾体内自身抗氧化能力；质量浓度大于10 g/L后，随质量浓度的增加，人参茎叶总皂苷抑制小菜蛾体内自身的抗氧化能力逐渐增强。人参茎叶总皂苷影响小菜蛾体内谷胱甘肽-S-转移酶活性，随处理液质量浓度的增加，其酶活与对照组相比明显降低，且呈现先降低后升高趋势；随处理时间的延长，其酶活性明显降低。人参茎叶总皂苷对小菜蛾羧酸酯酶活性有一定抑制作用，随处理液质量浓度的增加，其酶活呈先降低后升高趋势，处理组随处理时间的增加，酶活性降低，且酶活降随处理液质量浓度的增加而减小。初步表明，多功能氧化酶(MFO)、羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶，是人参茎叶总皂苷的作用靶标，其具体机制有待于进一步研究。

乙酰胆碱酯酶(AchE)是昆虫体内重要的神经系统酶，在昆虫化学传递中起着至关重要的作用。AchE能迅速分解乙酰胆碱，防止因乙酰胆碱积累造成的神经传递阻断。因此，抑制AchE活性势必会影响神经传递，造成昆虫生理生化过程失调甚至破坏，导致昆虫死亡。植物提取物(大戟科)能有效抑制AchE活性[21]，而雷公藤总生物碱对AchE活性无影响[22]。本研究测定了人参茎叶总皂苷对小菜蛾AchE活性的影响，结果表明：低质量浓度时人参茎叶总皂苷对小菜蛾体内AchE活性影响不大，中质量浓度能抑制AchE活性，而高质量浓度时抑制作用与中质量浓度相比有所减弱。初步确定，乙酰胆碱酯酶(AchE)是人参茎叶总皂苷的靶标，应进一步对乙酰胆碱、Na-K-ATP酶、Ca-Mg-ATP酶、谷氨酸、γ-氨基丁酸、谷-丙转氨酶、谷氨酸脱羧酶进行研究，以确定人参茎叶总皂苷作用的靶标。

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EffectofGinsengStemandLeaveSaponinontheFeeding,DetoxificationEnzymeandAcetylCholinesteraseActivityofPlutella xylostellaL//

XiGuangsheng

(JilinAgriculturalScienceandTechnologyUniversity,Jilin132101,P.R.China);

WangErhuan,YangHe

(JilinAgriculturalUniversity)

//JournalofNortheastForestryUniversity，2017,45(8)：97-100.

Withtheginsengstemandleavesaponin(GSLS)ofPanax ginsengC.A.MeyforPlutella xylostella (L.),wedeterminedtheactivityoffeeding,detoxificationenzymeandacetylcholinesterase.GSLShassignificantinhibitionoffeeding.LowconcentrationsofGLSLcanbeactivatedtheactivityofMFO,whilehigh-concentrationhastheeffectofinhibition.GSLScaninhibittheactivityofglutathione-S-transferaseandcarboxylesterase.GSLShaslittleeffectofAchEwhichinP. xylostellavivowiththelow-concentration,andthemid-concentrationshasinhibition.HighconcentrationofGSLShaslessdepressionthanmid-concentration.

PanaxginsengC. A. Mey； Ginseng Saponin；Plutellaxylostella(L.)

1)国家自然科学基金项目(31470420)；公益性行业(农业)科研专项项目(201303111)；吉林农业科技学院校内种子基金项目；吉林省高等学校人参(种植)高端科技创新平台项目。

奚广生，男，1967年9月生，吉林农业科技学院中药学院，教授。E-mail：zyxyxgs@126.com。

2017年3月14日。

S567.5+1；Q969.42+5.2

责任编辑：张 玉。