杨树NAC7转录因子基因应答盐胁迫表达1)

张雪梅 姚文静 赵凯 姜廷波 周博如

(林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，哈尔滨,150040)

杨树NAC7转录因子基因应答盐胁迫表达1)

张雪梅 姚文静 赵凯 姜廷波 周博如

(林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，哈尔滨,150040)

从小黑杨中克隆915 bp的NAC7转录因子基因(Potri.007G099400.1)cDNA，其编码304氨基酸，该蛋白属热稳定性较高的亲水性蛋白。用RT-qPCR分析杨树盐胁迫条件下NAC7基因表达情况，表明该基因对盐胁迫具有应答反应，且基因主要在根部表达。克隆获得1 062 bp的NAC7基因启动子DNA序列，其中含有许多胁迫应答元件，其驱动的GUS报告基因主要集中在根中表达，而在茎和叶中的表达很少，这个结果与NAC7基因表达进行RT-qPCR分析结果一致。

小黑杨；基因表达；启动子；转录因子；盐胁迫

植物的基因表达调控包括转录前调控、转录调控、转录后调控、翻译调控和翻译后调控等多种调控方式。顺式作用元件与转录因子互作的转录调控是基因表达调控的关键环节[1]。转录因子也称为反式作用因子，对下游基因的表达起着至关重要的作用，植物转录因子根据其结构域的不同可分为WRKY、bZIP、EIL、MYB、NAC、GATA、AP2/ERF、SBP等转录因子家族[2]。其中，NAC转录因子家族是植物特有的且为最庞大的一类转录因子[3-5]，其命名来源于NAM(noapicalmeristem)、ATAF1/2 和CUC2(cup-shapedcotyledon)3个基因的首字母[6]。该家族基因的N端含有NAC结构域的高度保守氨基酸序列，绝大多数基因含有1个NAM结构域[7]；C端是具有高度多样性的转录调控区，能转录激活或转录抑制活性。NAC转录因子能直接参与或通过调控参与干旱、高盐应答基因的表达，在植物处于非生物逆境胁迫时发挥重要作用[8]。基因的启动子位于结构基因5'端上游，能特异识别结合RNA聚合酶，并启动下游基因的表达[9-10]，是基因工程研究中表达载体的重要组成部分[11-12]。植物启动子包括组成型、诱导型和组织特异型3种类型，在植物转基因育种中广泛应用[13]。因此，研究基因表达特性及其启动子特点为明确目的基因功能具有重要意义。为探明NAC7(Potri.007G099400.1)基因应答盐胁迫的表达特点，本研究用RT-PCR从小黑杨(Populussimonii×P.nigra)中克隆NAC7基因cDNA片段，用RT-qPCR分析了NAC7基因在盐胁迫条件下的相对表达量变化。并用PCR扩增了NAC7基因上游启动子区DNA，用农杆菌介导瞬时侵染和组织化学染色鉴定NAC7启动子在拟南芥中的活性。为明确NAC7基因在杨树抗逆中的生物功能提供参考依据。

1 材料与方法

试验材料为培养1个月的小黑杨组培苗，在60%～70%相对湿度、14 h光/10 h暗、平均温度25 ℃条件下，在水中继续培养1个月后分为24组，每3组施以1种处理。分别用水(对照组)和0.15 mol/L NaCl处理0、3、6、9、12、24和36 h后，分别将样本的根、茎、叶-80 ℃保存，用于后续RNA提取和基因表达分析，所有处理和对照均包含3个生物重复。

1.1PnsNAC7基因表达的RT-qPCR分析

利用柱式植物RNA提取试剂盒(北京天恩泽基因科技有限公司，中国)提取总RNA。RT-qPCR反应：用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa公司，大连，中国)反转录合成cDNA。将合成的cDNA用无菌水稀释100倍，作为后续实时定量PCR的模板。实时定量PCR在ABI7500荧光PCR仪(应用生物系统公司)上进行。根据杨树数据库中NAC7(Potri.007G099400.1)基因cDNA序列，设计引物NAC7-F：5’-GCAGCAGCAGCAAGAACAAGCAGC-3’和NAC7-R：5’-GCCACTGGGCACACATCAAGAACC-3’。以ACT、EF1为内参，根据参考文献合成引物，所有引物均由上海生物工程有限公司合成。实时定量PCR反应体系和基因相对表达量计算参照本实验室前期研究方法。

1.2 启动子序列克隆和表达载体构建

用植物基因组DNA提取试剂盒提取小黑杨叶片DNA，根据Phytozome[14](https://phytozome.jgi.doe.gov/jbrowse/)毛果杨基因组序列设计正反向引物，NACPro-F：5’-GTCCACGACATCCAAAACCC-3’和NACPro-R:5’-CGTTCTTGGTGCTTTTCTTC-3’,以小黑杨DNA为模板进行PCR扩增。将目的DNA片段进行克隆，送到上海生物公司测序。将启动子DNA片段克隆到pBI121植物表达载体,替换其中的35S启动子构建NACPro植物表达载体。用农杆菌介导法侵染拟南芥幼苗，以GUS基因为报告基因，通过组织化学染色分析NAC7基因启动子的活性。

1.3 基因和启动子的生物信息学分析

利用NCBI数据库Blast对PnsNAC7基因序列以及推测的编码蛋白进行同源序列比对，并利用MEGA(Version 5.2)进行进化树的构建，将NAC7基因转录因子蛋白氨基酸序列放入ExPaSy在线Protparam软件(http://web/expasy/org/protparam/)进行分析，获得该基因蛋白分子量和等电点等理化属性，并利用Gene Structure Display Server分析该基因的结构。用植物顺式作用元件数据库PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)及PlantCARE(http://bioinfor matics.psb.ugent.be/wetools/plantcare/html/)对扩增的PnsNAC7基因启动子的转录调控元件进行分析，预测其主要的顺式作用元件。

2 结果与分析

2.1PnsNAC7基因的生物信息学分析

通过RT-PCR从小黑杨中获得NAC7基因cDNA编码区长度为915 bp，编码304氨基酸，蛋白质分子量为34.99 Ku，等电点为6.33，蛋白质不稳定系数为45.91，脂肪系数为60.39，其平均疏水性为-0.772。说明该蛋白的热稳定性较高，为亲水性蛋白。NAC7基因含有3个外显子和2个内含子，其中第一个内含子中具有HSE热胁迫应答元件和TC-rich repeats胁迫应答元件，可能在胁迫应答过程中发挥重要作用(图1)。

图1 Pns NAC7基因结构图

小黑杨PnsNAC7与其他物种NACs氨基酸多序列比对发现，PnsNAC7与毛果杨(Populustrichocarpa)、胡杨(Populuseuphratica)、木薯(Manihotesculenta)、蓖麻(Ricinuscommunis)NACs氨基酸序列的同源性较高，同源性达79%～99%。而与毛葡萄(Vitisquinquangularis)、咖啡(Coffeacanephora)、大豆(Glycinemax)和芝麻(Sesamumindicum)NACs氨基酸序列的同源性较低，同源性均在70%以下(图2)。

2.2 盐胁迫条件下NAC7基因的相对表达量

RT-qPCR结果表明，NAC7基因在杨树的茎和叶中表达量极少，主要集中在根中表达，经过盐胁迫处理后，在茎和叶中的应答不显著，而在根中随着胁迫时间增长，NAC7基因的相对表达量越来越大，处理12 h时表达量达到最大值，高达118.358倍，12 h之后其表达量呈现减少的趋势(表1)。以上结果表明NAC7基因表达对盐胁迫在具有明显的应答反应，且主要在根部应答盐胁迫，该可能在杨树应答过程中起着重要的作用。

表1 盐胁迫处理后根中NAC7基因的RT-qPCR检测

注：表中数据平均值±标准差。

2.3 NAC7启动子序列分析

以小黑杨的DNA为模板，以NACPro-F和NACPro-R为特异性引物进行PCR扩增，获得长度为1 062 bp的NAC7启动子片段。利用PLACE和Plant CARE软件分析结果表明，该启动子序列具有基本转录元件如核心元件TATA-box和控制转录效率及频率的CAAT-box,另外还有AE-box、G-box和G-Box等光响应元件， TGACG-motif茉莉酸甲酯应答元件和GARE-motif赤霉素响应元件以及乙烯响应元件ERE、脱落酸响应元件ABRE等(表2，图3)。

图2 小黑杨PnsNAC7基因系统进化树分析

元件名称核心序列元件功能ABRETACGTG脱落酸响应元件AE-boxAGAAACAT/TACAAAGA光响应元件G-BoxCACGTT光响应元件G-boxCACGAC/CGTGAA光响应元件BoxTTTCAAA光响应元件EREATTTCAAA乙烯响应元件GARE-mo-tifAAACAGA赤霉素响应元件TGA-ele-mentAACGAC生长素应答元件CircadianCAACAATATC参与昼夜节律调控的顺式作用元件Box-W1TTGACC病菌响应元件MBSCGGTCAMYB结合位点TGACG-motifCGGTCA茉莉酸甲酯应答元件CAAT-boxCAAAT/CCAAT/CAAT增强子区域普通顺式作用元件TATA-boxTATA启动子核心元件

2.4 拟南芥的瞬时表达

用农杆菌介导转化拟南芥组培苗，通过组织化学染色发现，GUS活性在根、茎、叶中均有表达，但其活性主要集中在根部，叶中和茎中少量表达(图4)，表明NAC7基因启动子活性具有组织特异性，其转录活性主要集中在植物根部，这个结论与NAC7基因的RT-qPCR结果一致。

A、B为培养3周拟南芥染色结果；A.pBI121-NACPro7侵染、B.未侵染的拟南芥(阴性对照)；C、D为培养5周拟南芥染色结果；C.pBI121-NACPro7侵染、D.未侵染的拟南芥(阴性对照)。

图4 瞬时转化拟南芥GUS组织化学染色

3 结论与讨论

本研究从小黑杨中克隆的NAC7基因对高盐胁迫具有应答反应，并且具有组织特异性，该基因主要在根中具有盐胁迫应答效应。NAC7基因的这个表达特点是由其启动子特点决定的。利用农杆菌介导的拟南芥瞬时侵染转化和GUS组织化学染色证明，NAC7启动子驱动下的GUS活性在根、茎、叶中均有表达，但其活性主要集中在根部，在茎中和叶中少量表达，这与NAC7定量分析结果一致。生物信息学分析表明，NAC7蛋白质为亲水性、热稳定性较高的蛋白，其启动子中含有许多胁迫应答元件，说明NAC7基因可能在杨树抗逆境胁迫中发挥重要作用。

杨树作为林木中的“拟南芥”[15]，具有适应能力强、抗寒、抗旱、耐盐碱等生物学特性[16]，也是重要的造林树种和绿化树种，鉴定杨树抗逆基因和诱导型启动子对利用基因工程改良杨树抗逆性具有重要作用。NAC转录因子是植物特有的一类转录因子家族，其中很多成员对非生物胁迫具有应答反应，柑橘在低温、干旱、高盐和ABA胁迫条件下NAC83基因呈现出差异性的表达[17]；番茄的SlNAC80的表达受低温、干旱、高盐和ABA的诱导，基因的诱导表达与启动子区的顺式作用元件密切相关[18]；茄子SmNAC1可能参与低温和高盐胁迫的耐受调节过程[19]；拟南芥NAC家族蛋白ANAC019和ANAC055可能作为转录激活因子来调控茉莉酸诱导表达[20]。启动子是调控基因表达的顺式作用开关，也是基因工程表达载体的一个重要元件，对基因调控具有重要意义[21-22]。如胡杨PeSCL7启动子包含许多与抗逆相关的功能元件[23]，马铃薯SGT3基因上游2 449 bp的启动子具有光调控相关的元件[24]，谷子膜结合NAC家族基因SiNAC启动子参与生长素、甲基茉莉酸和氧化胁迫应答[25]等等。本研究利用生物信息学的方法分析了NAC7基因的物理化学性质，并通过盐胁迫处理杨树克隆了NAC7转录因子基因，以GUS基因为报告基因构建了植物表达载体，利用农杆菌介导的瞬时侵染法处理拟南芥幼苗，确定了NAC7基因在根茎叶中的表达情况，为研究NAC7基因的盐胁迫分子机制和耐盐功能提供了依据。

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Expression Analysis ofNAC7 Transcription Factor Gene fromPopulussimonii×P.nigrain Response to Salt Stress//

Zhang Xuemei, Yao Wenjing, Zhao Kai, Jiang Tingbo, Zhou Boru

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)

//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(8)：6-9，13.

The 915 bp cDNA fragment ofNAC7 transcription factor gene (Potri.007G099400.1) was cloned fromPopulusnigra, which encodes 304 amino acids. The expression analysis ofNAC7 gene in poplar under salt stress by RT-qPCR showed that the gene had response to salt stress. The 1 062 bp DNA fragment ofNAC7 gene promoter was cloned, which contained many stress responsive elements, theGUSgene driven byNAC7 gene promoter mainly expressed in root, while the expression was rarely in leaves and stems, and the result was consistent with RT-qPCR ofNAC7 gene.

Populussimonii×P.nigra; Gene expression; Promoter; Transcription factor; Salt stress

张雪梅，女，1991年11月生，林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，硕士研究生。E-mail:1608901012@qq.com。

周博如，林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学),副教授。E-mail:boruzhou@yahoo.com。

2017年3月20日。

S722.3+6

1)国家“863”课题(2013AA102701)。

责任编辑：潘 华。