类黄酮参与调控中亚滨藜幼苗对盐胁迫的耐受性*

李 爽, 孙亮亮, 白丽丽, 王文颖, 万金鹏, 刘小京, 马金虎, 徐 进**



类黄酮参与调控中亚滨藜幼苗对盐胁迫的耐受性*

李 爽1,2, 孙亮亮1,3, 白丽丽1,4, 王文颖4, 万金鹏1, 刘小京5, 马金虎3, 徐 进1**

(1. 中国科学院西双版纳热带植物园 昆明 650223; 2. 中国科学院大学 北京 100049; 3. 山西农业大学农学院 太谷 030801; 4. 青海师范大学生命与地理科学学院 西宁 810008; 5. 中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心 石家庄 050022)

中亚滨藜是一种典型的盐生植物, 广泛分布在我国盐碱地区。前期研究中, 我们发现盐胁迫显著诱导了中亚滨藜幼苗根尖类黄酮的累积, 但其中的生理机理尚不完全清楚。在不同盐浓度(50 mmol∙L-1、100 mmol∙L-1、250 mmol∙L-1、500 mmol∙L-1、600 mmol∙L-1NaCl)处理下, 通过添加KNO3(25 mmol∙L-1、35 mmol∙L-1)和外源槲皮素 (100 nmol∙L-1quercetin), 采用植物生理学和生物化学等研究方法, 分析了盐诱导的类黄酮累积在调节中亚滨藜幼苗耐盐性中的生理机理。研究结果表明, 使用外源类黄酮类物质——槲皮素进行处理, 一方面更加抑制了盐胁迫下幼苗主根的生长, 同时还显著降低了根部H2O2的累积和幼苗在盐胁迫下的MDA水平, 但使可溶性糖含量显著升高。这些结果表明, 槲皮素通过抑制主根生长, 影响了中亚滨藜根系结构; 通过降低氧化伤害, 提高了中亚滨藜幼苗对盐胁迫的耐受性。盐胁迫还显著诱导了中亚滨藜幼苗对硝酸盐(NO3-)的累积, 使用25 mmol∙L-1和35 mmol∙L-1KNO3处理, 可显著诱导其幼苗根尖类黄酮的累积。这些结果表明, 硝态氮可能通过影响类黄酮途径, 从而参与调控了中亚滨藜幼苗的耐盐性。本研究为进一步揭示中亚滨藜耐盐的生理与分子机制, 以及类黄酮参与调控中亚滨藜耐盐性的生理与分子机理提供了理论基础; 同时为使用现代生物技术和农艺措施提高作物耐盐性、改良盐碱地提供了理论依据和技术支持。

中亚滨藜; 盐胁迫; 类黄酮; 硝酸盐; 根系

土壤盐渍化是导致作物生长不良、品质和产量下降的一个重要原因。研究表明, 盐胁迫对植物的毒害包括渗透胁迫、离子毒害、氧化胁迫和营养失衡等方面[1-2]。首先, 由于外界盐离子浓度高导致水势下降, 植物吸水困难, 产生渗透胁迫[3]; 盐胁迫降低了抗氧化酶的活性, 促进了活性氧(ROS)的累积和膜脂过氧化[4]; 从植物营养的角度来看, 盐胁迫抑制了根系对营养元素(如N、P、Zn、Fe等)的吸收和累积, 从而影响生长[5]。

中亚滨藜()是一种典型的盐生植物, 广泛分布在我国华北、西北地区。盆栽和田间试验表明, 中亚滨藜的平均耐盐能力在15 g(Na+)×kg-1(soil), 耐盐极限为20 g(Na+)×kg-1(soil)[6]。近年来, 对中亚滨藜的耐盐机理有了较为深入的理解[6-7]。

类黄酮是植物体内一种重要的次生代谢物质, 广泛参与了调控植物生长发育和抗逆的各种生物学过程。从苹果()外果皮中提取纯化的类黄酮类化合物Naringenin和rutin, 可以有效地阻止DNA损伤[8]。类黄酮含量较低的植物, 表现出对紫外线辐射更高的敏感性[9-10]。许多研究表明, 类黄酮参与调控了植物体内生长素的极性运输[11-12]。类黄酮合成缺陷的拟南芥()()突变体表现出较高的生长素运输能力, 并引起了表型改变[13]。这些研究表明, 类黄酮在植物生长发育过程中起着重要的调节作用。

植物氮素营养主要包括铵态氮(NH4+)与硝态氮(NO3-)两种形式, 但是植物大量吸收铵态氮会导致铵中毒, 而吸收硝态氮则不会产生危害[14]。因此, 通常情况下随着外界供氮水平的提高, 植物可以吸收超过本身生长所需的硝态氮量, 其中的一部分被硝酸还原酶(NR)还原成NH4+, 而多余的NO3-都存贮在液泡中[15]。这些在液泡中存储的NO3-起到了维持细胞渗透平衡的功能[16]。Song等[17]在盐地碱蓬()中的研究表明, 植株对NO3-的累积能力与耐盐能力呈一定的正相关。在大麦()中的研究表明, 耐盐性弱的品种在盐胁迫下对NO3-的累积能力明显下降, 而耐盐性强的品种对NO3-的吸收反而提高[18]。在盐生植物囊果碱蓬()中的研究表明, 长期盐胁迫下, 会形成有利于NO3-吸收的运输蛋白系统[19]。然而, NO3-仅仅是提供了渗透调节物质, 还是参与了某种耐盐的机制, 目前为止还缺乏详细的研究。前期研究中, 我们发现, 盐胁迫显著诱导了中亚滨藜幼苗根系类黄酮的累积, 但其中的生理机理尚不清楚。因此, 本研究以中亚滨藜为材料, 对类黄酮参与调控中亚滨藜幼苗对盐胁迫的耐受性进行了研究。这些研究结果可为深入探明类黄酮在参与调控植物耐盐性中的生理与分子机理提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 植物材料及试验设计

中亚滨藜种子由中国科学院南皮生态农业试验站提供。以中亚滨藜的黄色种子为研究材料, 植物材料均采用水培方法, 人工气候室内生长, 基本条件: 光强300 μmol×m-2×s-1, 光周期14 h; 温度(28±1) ℃。种子在湿润的双层滤纸上萌发催芽。Hoagland营养液配方参照Xu等[7]的方法。萌发4 d后的幼苗, 转移到各处理液中。盐处理浓度分别为0 mmol∙L-1、50 mmol∙L-1、100 mmol∙L-1、250 mmol∙L-1、500 mmol∙L-1和600 mmol∙L-1NaCl; 硝态氮处理使用25 mmol∙L-1、35 mmol∙L-1KNO3; 外源槲皮素处理浓度为100 nmol∙L-1。幼苗在25 ℃, 3 000 lx, 16 h/8 h光周期下培养2 d后, 取样进行如下生理学分析。每处理重复3次。

1.2 植物生理指标的测定

1)根长测定: 在各处理液中培养2 d后, 将根平展在培养皿中, 在扫描仪(EPSON PERFECTION V350 PHOTO)上扫描根部, 通过photoshop软件测量根长。每处理取30株幼苗进行统计分析。

2)类黄酮荧光检测:参考Murphy等[13]的方法, 使用DPBA(2-aminoethyl diphenylborinate)荧光染料进行根尖类黄酮含量分析。幼苗在各处理液中培养2 d后, 剪取根尖2 cm, 置于DPBA工作液中进行染色。每处理取15株幼苗的主根根尖进行分析。

3)可溶性糖、H2O2、NO3-和MDA含量测定: 幼苗在各处理液中培养2 d后, 分别剪取幼苗的根部或全株, 准确称取500 mg, 置于EP管中准备进行生化分析。可溶性糖、NO3-、H2O2和MDA含量测定参照Xu等[7,20]的方法。可溶性糖和MDA含量测定取全株幼苗, 而NO3-和H2O2含量测定取处理后的幼苗根部进行检测。重复3次。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫诱导了中亚滨藜根尖类黄酮的累积

为检测盐胁迫是否影响中亚滨藜根尖类黄酮水平, 使用DPBA荧光染料对盐胁迫下中亚滨藜根尖类黄酮的含量进行了检测。如图1, DPBA荧光染色分析表明, 盐胁迫显著诱导了中亚滨藜幼苗根部类黄酮的累积; 并且随着盐浓度的升高, DPBA荧光逐渐增强。但在高浓度的盐处理下(500 mmol∙L-1和600 mmol∙L-1NaCl), DPBA荧光显著降低。

2.2 外源槲皮素抑制了盐胁迫下中亚滨藜幼苗主根的生长

为探明类黄酮在调控盐胁迫下中亚滨藜幼苗根系生长中的作用, 使用槲皮素处理, 分析外源类黄酮对盐胁迫下中亚滨藜种子萌发和早期幼苗根长的影响。槲皮素是植物体内一种重要的类黄酮类物质, 并被广泛用于研究类黄酮在植物生长发育中作用[10]。如图2, 100 nmol∙L-1槲皮素处理显著抑制了中亚滨藜在盐胁迫下幼苗主根生长。盐胁迫显著抑制了中亚滨藜幼苗主根生长, 外源槲皮素处理后, 更加抑制了主根幼苗的生长。这些结果表明, 盐胁迫诱导的根尖槲皮素累积, 可能是引起主根抑制的原因之一。

2.3 外源槲皮素提高了盐胁迫下叶片可溶性糖含量、降低了MDA含量和根部H2O2水平

为深入了解类黄酮对中亚滨藜幼苗耐盐性的影响, 我们还分析了槲皮素对盐胁迫下幼苗可溶性糖、MDA和根部H2O2水平的影响。盐胁迫显著降低了叶片可溶性糖的含量。盐胁迫下, 经外源槲皮素处理的幼苗, 叶片中可溶性糖含量比单独盐胁迫处理下的幼苗显著提高(图3A)。

盐胁迫显著升高了叶片中MDA含量和根部H2O2水平。盐胁迫下, 经外源槲皮素处理的幼苗叶片中, MDA含量比单独盐胁迫处理下的幼苗显著降低(图3B); 使用槲皮素处理还显著降低了根部H2O2的水平(图3C)。这些结果表明, 外源槲皮素处理抑制了主根生长, 但提高了幼苗的耐盐性。

2.4 盐胁迫诱导了中亚滨藜幼苗根部对NO3-的累积

已有研究表明, 植株对NO3-的累积能力与耐盐能力呈一定的正相关[17-18]。因此, 我们检测了盐胁迫下中亚滨藜幼苗根部对NO3-的累积水平。我们发现, 盐胁迫显著影响了幼苗根系NO3-的水平。在0~250 mmol∙L-1盐胁迫下, 幼苗根系中NO3-的水平逐渐升高; 但更高浓度的盐处理下(500 mmol∙L-1和600 mmol∙L-1NaCl), 植株根部NO3-含量显著降低(图4)。

2.5 NO3-处理诱导了根尖类黄酮的累积

为探明幼苗体内NO3-的累积是否影响了类黄酮的水平, 使用DPBA荧光染色, 分析了不同NO3-处理下幼苗根尖类黄酮的水平。如图5, 不同浓度KNO3处理下, 中亚滨藜幼苗根尖DPBA荧光均显著增强。这些结果表明, 幼苗体内NO3-的累积提高了根尖类黄酮的水平。

3 讨论

通常情况下, 盐胁迫会抑制植物对NO3-的吸收和运输, 从而加重了植物的渗透胁迫。例如, 拟南芥和小麦()幼苗对NO3-的吸收与运输会受到高浓度盐处理的抑制。但盐生植物却表现出明显的不同。一些研究表明, 盐生植物(如盐地碱蓬)对NO3-的累积能力与耐盐能力呈一定的正相关; 在大麦中的研究也表明, 耐盐性强的品种对NO3-的吸收提高, 而耐盐性弱的品种在盐胁迫下对NO3-的累积能力明显下降[17-18]。这些研究表明, NO3-的吸收和累积是盐生植物维持耐盐能力的一个重要生理机制, 但其机理尚不清楚。本研究发现, 不同浓度的盐胁迫均显著诱导了中亚滨藜幼苗根系和叶片中NO3-的含量, 表明NO3-可能参与调控了中亚滨藜耐盐响应过程。进一步的研究发现, 盐胁迫和NO3-处理均能显著提高中亚滨藜幼苗根部类黄酮的累积; 外源类黄酮处理下的幼苗, 主根生长受到抑制, 但叶片中叶绿素和可溶性糖的含量升高, 同时外源类黄酮处理还降低了幼苗MDA含量和H2O2的水平。这些结果表明, 类黄酮改变了中亚滨藜幼苗的根系构型, 同时提高了幼苗的抗氧化能力, 因此提高了中亚滨藜幼苗对盐胁迫的耐受性。

植物主根生长分别受ROS信号途径和生长素—细胞分裂素途径调控[21]。根尖高浓度的H2O2抑制主根生长, 但O2-在根尖分生区的累积则促进了主根伸长[21-22]。因此, 植物的主根通过精确调控根尖ROS平衡来决定主根的生长[21]。影响主根生长的另一个重要的信号途径是生长素—细胞分裂素信号途径。细胞分裂素通过影响Aux/IAA蛋白SHY2, 抑制了主根生长; 生长素信号途径通过调控PLETHORA(PLT)蛋白在根尖的梯度分布, 影响了根尖分生区发育, 从而影响了主根生长[23]。类黄酮是植物体内一类重要的具有抗氧化和ROS清除能力的次生代谢物质[24-25]; 类黄酮还影响植物体内正常的IAA代谢, 并干扰生长素的运输[25-27]。在本研究发现, 外源类黄酮类物质槲皮素处理后, 中亚滨藜幼苗根尖H2O2含量降低, 但是主根生长受到抑制。这表明, 外源类黄酮对中亚滨藜幼苗主根生长的抑制作用不是通过ROS信号途径。已有研究表明, 类黄酮是生长素运输的抑制剂[11-12]。使用外源类黄酮槲皮素处理后, 通过抑制生长素输出蛋白PIN蛋白在根尖的累积, 降低了生长素从地上部向根尖的极性运输过程, 从而减少了根尖生长素的累积, 因而影响了主根生长[25-26]。由此推测, 外源槲皮素可能正是通过这一途径抑制了中亚滨藜幼苗的主根生长, 其中详细的分子机制还有待于进一步研究。我们的结果表明, 盐胁迫下中亚滨藜幼苗根部累积的类黄酮参与调控了盐诱导的根系结构重排。

4 结论

本研究结果表明, 盐胁迫诱导了中亚滨藜幼苗对NO3-的累积, 进而提高了幼苗中类黄酮的水平; 类黄酮通过降低根部MDA含量和H2O2水平, 缓解了盐胁迫对幼苗的氧化伤害, 从而提高了幼苗的耐盐性; 同时盐胁迫诱导的类黄酮累积还抑制了幼苗主根的生长, 因而改变了根系结构。这些研究表明, 盐胁迫诱导的中亚滨藜幼苗对NO3-的累积, 可能通过类黄酮途径参与调控中亚滨藜的耐盐性。本研究揭示了类黄酮在调控植物耐非生物逆境中的新功能, 为继续深入了解类黄酮的生物学功能, 及进一步通过生物技术手段提高植物耐盐性提供了理论依据。

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Flavonoid is associated with salt stress tolerance inseedlings*

LI Shuang1,2, SUN Liangliang1,3, BAI Lili1,4, WANG Wenying4, WAN Jinpeng1, LIU Xiaojing5, MA Jinhu3, XU Jin1**

(1. Xishuangbanna Tropical Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. College of Agronomy, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China; 4. College of Life Science and Geography, Qinghai Normal University, Xining 810008, China; 5. Center for Agricultural Resources Research, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Shijiazhuang 050022, China)

is a typical halophyte that widely grows in saline areas of China. In earlier studies, we found that salt stress markedly induced the accumulation of flavonoid in the roots ofseedlings. By integrating the physiological and biochemical analyses in this study, the physiological mechanisms of salt-induced flavonoid accumulation in the roots ofseedlings were investigated by supplementing with KNO3(25 and 35 mmol∙L-1) and exogenous quercetin (100 nmol∙L-1quercetin) in different salinity-treated seedlings (50, 100, 250, 500 and 600 mmol∙L-1NaCl). Our results indicated that supplementation of exogenous quercetin markedly suppressed primary root (PR) growth and the accumulation of both H2O2and MDA in roots, whereas it markedly increased soluble sugar levels in seedlings. This indicated that exogenous flavonoid —quercetin affected root system architecture by suppressing PR growth and improved salt tolerance by reducing oxidative damage inseedlings. Salt stress also induced the accumulation of nitrate (NO3-) inseedlings. We found that treatment with 25 and 35 mmol∙L-1KNO3markedly induced the accumulation of flavonoid in root tips ofseedlings. All in all, the results indicated that nitrate modulated salt tolerance inseedlings by flavonoid pathway. This knowledge was helpful for further elucidating the physiological and molecular mechanisms of salt tolerance in. It also provided further insights into novel strategies for breeding and cultivating salt-tolerant crops and improved saline-alkali soils using modern biotechnology and agricultural measure.

; Salt stress; Flavonoid; Nitrate; Roots

Jan. 22, 2017; accepted Apr. 27, 2017

X592

A

1671-3990(2017)09-1345-06

10.13930/j.cnki.cjea.170079

2017-01-22

2017-04-27

* 国家自然科学基金项目(31272239, 31170228)和云南省中青年学术带头人后备人才项目(2014HB043)资助

* This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31272239, 31170228) and Yunnan Province Foundation for Leaders of Disciplines in Science (2014HB043).

** Corresponding author, E-mail:xujin@xtbg.ac.cn

**通讯作者:徐进, 主要从事植物耐逆的生理与分子生物学研究。E-mail: xujin@xtbg.ac.cn

李爽, 主要从事盐生植物耐逆机理研究。

李爽, 孙亮亮, 白丽丽, 王文颖, 万金鹏, 刘小京, 马金虎, 徐进. 类黄酮参与调控中亚滨藜幼苗对盐胁迫的耐受性[J]. 中国生态农业学报, 2017, 25(9): 1345-1350

Li S, Sun L L, Bai L L, Wang W Y, Wan J P, Liu X J, Ma J H, Xu J. Flavonoid is associated with salt stress tolerance inseedlings[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2017, 25(9): 1345-1350