一指禅推拿对坐骨神经损伤大鼠神经形态及功能的影响

卢新刚，喻立炜，苟海昕，陈敬贤，吴烨琳，盛晖，王佳禄，朱鼎成

1.复旦大学附属华东医院，上海 200040；2.上海交通大学附属瑞金医院，上海 200025

一指禅推拿对坐骨神经损伤大鼠神经形态及功能的影响

卢新刚1，喻立炜1，苟海昕1，陈敬贤2，吴烨琳1，盛晖1，王佳禄1，朱鼎成1

1.复旦大学附属华东医院，上海 200040；2.上海交通大学附属瑞金医院，上海 200025

目的观察一指禅推拿对坐骨神经损伤大鼠神经形态及功能的影响。方法 暴露坐骨神经，用显微持针器钳夹坐骨神经制作坐骨神经损伤模型。SD大鼠随机分为假手术组、模型组和推拿组，假手术组暴露神经但不夹持。造模7 d后，推拿组大鼠一指禅推法治疗30 d，每日1次。30 d后，检测大鼠坐骨神经功能指数（SFI）、右下肢运动功能指数（BBB），HE染色、免疫组化检测和电镜观察大鼠患侧坐骨神经变化。结果 与模型组比较，推拿组可有效加快SFI恢复，升高BBB，促进坐骨神经形态结构恢复，S-100β蛋白含量升高，促进新生神经超微结构生长及恢复。结论 一指禅推拿可有效促进大鼠坐骨神经损伤后神经形态及功能恢复。

一指禅推拿；坐骨神经损伤；大鼠

坐骨神经损伤主要发生于幼儿、老年人等，其损伤后神经的再生及功能恢复目前尚无特别有效的方法。一指禅推拿操作强调拇指指面吸定，以快速运动来治疗疾病，临床常用于治疗坐骨神经痛。然而，一指禅推拿对于神经损伤的临床和基础研究较少，本实验观察一指禅推拿对大鼠坐骨神经损伤模型的神经形态及功能的影响，为临床应用提供基础。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

SPF级SD大鼠36只，雄性，鼠龄8周左右，体质量 150～170 g，上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物许可证号 SCXK（沪）2013-2016，饲养于复旦大学附属华东医院上海市老年医学研究所动物房，12 h/12 h昼夜交替光照，自由摄食饮水。大鼠适应性喂养7 d后，随机分为假手术组、模型组和推拿组，每组12只。

1.2 主要试剂与仪器

水合氯醛（上海凌峰化学有限公司），生理盐水（上海海尼药业有限公司），S-100β抗体（美国Abcam公司，ab11181）。透射电镜（日本电子有限公司，JEM-1010），切片机[孚光精仪（中国）有限公司，HSK-205]，显微镜（尼康中国科技有限公司，E-200），肌电图仪（武汉天鹰医疗设备有限公司，M-800C），万分之一电子天平（上海利康有限公司，FA-114）。

1.3 造模

[1]方法制作大鼠坐骨神经损伤模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉，俯卧位固定，右侧手术区（右侧臀股交界处）剪毛、酒精消毒，沿坐骨神经走行方向剪开大约1 cm，在梨状肌下缘逐步探寻并暴露坐骨神经，用显微持针器钳夹坐骨神经干30 s，松开30 s，再夹30 s，造成神经纤维全部断裂。造模后钳夹伤处坐骨神经组织进行病理学检查，HE染色显示神经外膜连续性已经消失，神经轴突发生明显断裂，电生理检测发现经有效刺激后无动作电位产生，判断造模成功[2]。推拿组同模型组。假手术组采用同样方法对大鼠进行预处理，暴露坐骨神经，但不进行夹持，对神经无损伤。

1.4 干预方法

推拿组：首先，对推拿医师进行相关推拿训练，采用一指禅推法（手握空拳，腕掌悬屈，拇指伸直，用拇指的指端、指腹和桡侧偏峰面着力于穴位上，运用腕部的横向来回摆动以带动拇指关节的屈伸活动），要求能实现推拿操作规范化，达到直径约5 mm大拇指末端接触大鼠，频率120次/min，接触力度为4 N，待训练合格后开始实验。造模后第7日起，将大鼠固定于大鼠固定架上，参考《实验针灸学》[3]进行穴位定位，选择右侧环跳（后肢髋关节后上缘）、阳陵泉（距后三里上外侧5 mm，在腓骨头前下方凹陷处）、足三里（腓骨小头下约5 mm），待大鼠安静后，按照上述推拿标准对上述穴位进行一指禅推拿，每穴2 min，并沿足少阳胆经腰部及下肢循行部位一指禅推法移行4 min，注重紧推慢移，全部治疗共计10 min。每日1次，共30次。模型组和假手术组无相关干预。

1.5 观察指标

1.5.1 行为学检测 坐骨神经功能指数（sciatic functional index，SFI）为经典反映坐骨神经功能指标。参考文献[4]制作纸箱（80 cm×10 cm×10 cm），行走道上铺针式打印纸，用印盒将大鼠双后足染色后在箱中直线行走，在纸上留下 3～4对足印，量取大鼠手术侧足、正常侧足的相应变量：足印长度（PL），足趾宽度（TS），中间足趾距离（IT）。两侧足区分：实验足一侧（experiment side，E），正常足一侧（normal side，N）。当动物用足背行走或由于足挛缩无法测量PL、TS或IT时，则定PL＝80 mm、TS＝6 mm和IT＝6 mm。测量全部变量后，计算SFI[-38.3（EPLNPL）÷NPL＋109.5（ETS－NTS）÷NTS＋13.3（EIT－NIT）÷NIT－8.8]。SFI＝0为正常值，SFI≤-100为神经完全断离。

1.5.2 大鼠运动功能评价 大鼠右下肢运动功能恢复情况参考Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）评分[5]，最高分为21分，分数越高，运动功能越强。

1.5.3 坐骨神经病理学形态观察 HE染色观察大鼠坐骨神经形态[6]，石蜡切片染色5 min，脱水10 min，二甲苯透明2 min，中性树脂封片，普通显微镜下观察神经组织特征、结构完整度。S-100β是重要的参与神经系统修复的蛋白，表达水平越高神经修复活动越强，免疫组化观察S-100β表达水平[6]。大鼠治疗结束后，取出坐骨神经，选取损伤段10 mm，4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，切成5 μm薄片。60 ℃恒温箱中烘烤20 min，无水乙醇、95%乙醇、75%乙醇梯度脱蜡各5 min，PBS洗3次×5 min，配制新鲜的3%甲醇-H2O2溶液，室温封闭5 min，抗原修复，S-100β一抗37 ℃、孵育1 h，生物素二抗37 ℃、孵育20 min，添加SABC 37℃、孵育20 min，PBS洗4次×5 min，Diaminobezidin（DAB）染色20 min，75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇梯度脱水各5 min，二甲苯透明2 min，封片，镜检，各组随机抽取3张图片，每张图片随机选取2个视野观察S-100β蛋白表达，用Image-Plus6.0软件对S-100β蛋白平均光密度进行半定量分析。

1.5.4 坐骨神经超微结构电镜观察 参考文献[7]电镜观察各组大鼠坐骨神经超微结构。取大鼠右侧坐骨神经损伤处10 mm，取新鲜组织2.5%戊二醛前固定2 h，再漂洗，1%锇酸后固定1 h，梯度丙酮脱水，环氧树脂包埋，半薄切片定位，切片（50 nm），柠檬酸铅染色。透射电子显微镜观察有髓神经纤维髓鞘、轴索、雪旺细胞的结构形态和分布情况。生物医学图像分析系统测量有髓神经轴突直径、髓鞘厚度。

1.6 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料以±s表示，组间比较采用方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状况

治疗期间所有大鼠基本情况良好，正常摄食饮水，未发生活动减少、呕吐、死亡等现象。

2.2 一指禅推拿对模型大鼠坐骨神经功能指数的影响

治疗前，推拿组和模型组较假手术组SFI明显降低（P＜0.01）；治疗 30次后，推拿组和模型组 SFI均上升，推拿组上升明显，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见表1。

表1 各组大鼠治疗前后SFI比较（±s）

表1 各组大鼠治疗前后SFI比较（±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05

组别 只数 治疗前 治疗后假手术组 12 0 0模型组 12 -91.36±7.19** -78.25±5.26*推拿组 12 -93.01±6.56** -28.47±3.94#

2.3 一指禅推拿对模型大鼠运动功能评分的影响

治疗前，推拿组和模型组较假手术组BBB评分明显降低（P＜0.05）。经治疗30次后，模型组BBB评分较治疗前略有上升，推拿组BBB评分上升明显，与模型组比较差异有统计意义（P＜0.05）。结果见表2。

表2 各组大鼠治疗前后BBB评分比较（±s）

表2 各组大鼠治疗前后BBB评分比较（±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

组别 只数 治疗前 治疗后假手术组 12 20.59±4.50 21.37±4.27模型组 12 8.05±2.16* 9.02±2.20*推拿组 12 7.93±2.04* 17.35±4.34#

2.4 坐骨神经HE染色和S-100β蛋白免疫组化结果

HE染色结果显示，假手术组坐骨神经结构紧密，无空泡，神经外膜连续完整；模型组坐骨神经有明显的 Wallerian变性并伴随髓鞘分解，神经纤维结构不完整，略有空泡，纺锤体细胞增殖，神经纤维有重新连接，相邻轴突退化，髓鞘塌陷，雪旺细胞有增殖；推拿组损伤坐骨神经恢复明显较好，空泡少，结构相对完整，雪旺细胞增殖明显，见图1。S-100β表达水平与神经组织损伤后修复强度直接相关，S-100β表达能促进损伤神经轴突再生，促进坐骨神经修复[8]，免疫组化结果显示，模型组较假手术组 S-100β蛋白水平上升，推拿组S-100β蛋白水平上升明显，见图2。S-100β表达水平半定量结果见表3。

2.5 坐骨神经电镜观察结果

治疗后电镜观察结果显示，假手术组髓鞘厚，神经纤维致密，形态均匀，神经纤维排列整齐；模型组神经纤维密度下降明显，形态不规则，髓鞘薄；与模型组比较，推拿组促进神经纤维增生、形态恢复，髓鞘增厚。结果见图3、表4。

图1 各组大鼠坐骨神经形态观察（HE染色，×200）

图2 各组大鼠坐骨神经S-100β形态观察（免疫组化染色，×200）

表3 各组大鼠坐骨神经S-100β蛋白定量水平比较（±s，%）

表3 各组大鼠坐骨神经S-100β蛋白定量水平比较（±s，%）

注：与假手术组比较，***P＜0.001；与模型组比较，##P＜0.01

组别 只数 S -1 0 0 β假手术组 1 2 3 . 5 8 ± 0 . 6 5模型组 1 2 1 4 . 3 5 ± 4 . 1 9***推拿组 1 2 3 6 . 0 1 ± 6 . 5 6***##

图3 各组大鼠坐骨神经超微结构（×15 000）

表4 各组大鼠治疗后坐骨神经超微结构形态学指标比较（±s）

表4 各组大鼠治疗后坐骨神经超微结构形态学指标比较（±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

组别 只数 每个横截面有髓轴突总数/（× 1 04） 有髓轴突平均直径/ μ m 轴突与纤维直径比假手术组 1 2 0 . 5 3 1 ± 0 . 0 5 2 4 . 9 6 2 ± 0 . 6 5 8 0 . 5 9 6 ± 0 . 0 8 4模型组 1 2 0 . 2 0 3 ± 0 . 0 3 2* 2 . 3 9 3 ± 0 . 2 3 5* 0 . 9 8 6 ± 0 . 0 7 8*推拿组 1 2 0 . 3 5 5 ± 0 . 0 1 7# 3 . 5 0 6 ± 0 . 3 7 4# 0 . 7 5 9 ± 0 . 0 7 0#

3 讨论

推拿疗法通过手法对人体体表的刺激及产生热效应，从而加速气血的运行，起到疏通经络、行气活血的作用。一指禅推拿为一指禅治法的精华，即以拇指120次/min摆动的频率持续作用于所施治的穴位，意图以指代针，手到病除。手法应柔中寓刚，刚柔相济，以柔和为贵，用力应深透、有节律且持久，以指代针、力透豀谷。

坐骨神经损伤属中医学“痿症”范畴，概因经络损伤、气血经脉阻滞、局部失养所致。根据针灸推拿学“治痿独取阳明”和“经脉所过，主治所及”的理论，治疗应当选取足阳明经和足少阳经穴为主。同时，遵循穴位-神经-肌肉相关取穴原则，选取环跳、阳陵泉、足三里为主要的施治穴位。环跳、阳陵泉为足少阳胆经经穴。《素问•气穴论篇》云：“环跳，足少阳、太阳二脉之会。”该穴功效祛风化湿，可利腰腿、通经络，是治疗腰痛、坐骨神经痛的常用穴位[9]。阳陵泉，《灵枢•邪气藏府病形》有“筋急，阳陵泉主之”，是与环跳配合治疗腰腿疾患的要穴。其下为腓总神经分为腓浅及腓深神经处，支配腓肠肌，是坐骨神经主要支配区域及下肢主要运动功能的靶点[10]。足三里为足阳明经要穴，主司调补气血，使血有所充，筋有所养，是治疗一切下肢痿软无力的要穴。

实验结果表明，一指禅推拿施治于“环跳”“足三里”和“阳陵泉”，可有效促进大鼠损伤坐骨神经恢复，提高损伤侧肢体运动功能，促进损伤坐骨神经超微结构修复，保持坐骨神经形态完整，升高损伤坐骨神经 S-100β表达水平。既往推拿治疗坐骨神经损伤基础研究多采用手法模拟治疗仪，手法模拟了点、拨、揉等方法。本实验中医师经统一培训后，采用一指禅推拿对3穴推拿治疗取得较好疗效，表明一指禅推拿是主要的起效手法，确定主要施治穴位为足三里、阳陵泉和环跳。

参考文献：

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[3]李忠仁.实验针灸学[M].北京：中国中医药出版社,2008：33-35.

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[5]于跃,吴剑聪,李小琴,等.电针影响坐骨神经损伤大鼠脊髓前角神经营养因子-3表达的研究[J].环球中医药,2014,7(4)：262-265.

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Effects of One Finger Massage on Nerve Morphology and Function of Sciatic Nerve Injury Rats

LU Xin-gang1, YU Li-wei1, GOU Hai-xin1, CHEN Jing-xian2, WU Ye-lin1, SHENG Hui1, WANG Jia-lu1, ZHU Ding-cheng1(1. Huadong Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China; 2. Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025, China)

ObjectiveTo study the effects of one finger massage on sciatic nerve injury rats. Methods The sciatic nerves were exposed, and the sciatic nerve was held by micro needles to make the sciatic nerve injury model. SD rats were randomly divided into sham-operation group, model group and massage group. In the sham-operation group, the sciatic nerves were exposed but not held. 7 d after the establishment of modeling, rats in massage group

one finger massage for 30 d. After 30 d, SFI and BBB of sciatic nerves were detected. HE staining, transmission electron microscope and immunochemistry assay were used to measure the changes of sciatic nerves. Results Compared with model group, massage group could speed up the recovery of SFI and increase BBB, promote the recovery of sciatic nerve morphology, increased protein level of S-100β, and enhance ultrastructure of newborn nerve growth and recovery. Conclusion One finger massage can effectively promote neurological and functional recovery after sciatic nerve injury in rats.

one finger massage; sciatic nerve injury; rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.09.009

R247.4-03

A

1005-5304(2017)09-0035-04

2016-11-22）

（

2017-01-04；编辑：华强）

上海市科学技术委员会项目（13401907000）;上海市中医药“杏林新星”行动计划（ZY3-RCPY-2-2031）