利用分子标记辅助选择改良浙恢7954的稻米品质

牛凯萌，徐俊波，钟 亮，王 华，朱 英，*

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004； 2.浙江省农业科学院 病毒学与生物技术研究所，浙江省植物有害生物防控重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，浙江 杭州 310021)

利用分子标记辅助选择改良浙恢7954的稻米品质

牛凯萌1，2，徐俊波2，钟 亮2，王 华2，朱 英2，*

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004； 2.浙江省农业科学院 病毒学与生物技术研究所，浙江省植物有害生物防控重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，浙江 杭州 310021)

浙江省第1个获得国家植物新品种保护的浙恢7954是杂交稻育种中综合性状优异的恢复系，但其直链淀粉含量偏高(约25%)，食味品质较差。多年来，通过传统育种手段改良该品种的稻米品质，收效甚微。利用Wx基因第1内含子剪切处的SNP位点，设计分子标记，以综合性状优异且直链淀粉含量中低的93-11为供体，借助分子标记辅助选择技术，通过杂交和多代回交，获得了直链淀粉含量中等，食味品质明显提升，而粒型、粒重、精米率等其他综合性状近似于亲本浙恢7954的品系L2和L9，表明成功地改良了浙恢7954的稻米品质。SNP分型结果显示，除Wx位点外，L2和L9在浙恢7954背景下导入的93-11片段均不到7%。这些中间材料的获得，为高产优质的杂交稻亲本及其杂交组合选育提供了良好的基础。

浙恢7954；直链淀粉含量；蜡质基因；分子标记辅助育种；SNP

水稻是世界上重要的粮食作物之一，全世界近一半的人口以稻米为主食。矮秆育种和杂种优势的利用使我国水稻产量有了2次大的飞跃，为解决我国粮食问题作出了巨大贡献。近年来，随着生活水平的提高，人们对稻米品质的要求也越来越高。实现包括稻米等主要粮食作物在内的农产品供给由量向质的改变，加强农业供给侧结构性改革也是新形势下中央对“三农”工作提出的最新要求[1]。在此背景下，水稻育种的指导思想由过去一味地追求高产向着“优质安全兼顾高产”的方向转变。

淀粉是稻米的主要成分，含量为70%～90%，由直链淀粉和支链淀粉组成。直链淀粉含量(AC)、糊化温度(GT)、胶稠度(GC)是衡量稻米蒸煮加工和食用品质优劣的重要理化指标，其中，直链淀粉含量起决定性作用。稻米的直链淀粉含量受水稻蜡质基因(Wx)控制[2]。研究表明，不同水稻品种直链淀粉含量的高低常常由Wx基因第1内含子的剪接效率决定[3]，而第1内含子中供体+1位置的碱基G/T多态性与第1内含子的剪接效率直接相关[4]。含GG型Wx基因的水稻通常具有高直链淀粉含量(≥20%)，而含TT型Wx基因的水稻直链淀粉含量中低(<20%)。由此，蔡秀玲等[5]开发了一个与稻米直链淀粉含量完全连锁的分子标记PCR-AccI。

浙恢7954是浙江省第1个获得国家植物新品种保护的水稻品种，也是杂交稻育种中难得的恢复力强、配合力高、综合性状优异的恢复系，由其选配出的籼粳亚种间超高产杂交水稻组合Ⅱ优7954，克服了籼粳杂种优势利用中杂种结实率偏低和充实度较差的难题，在全国得到了广泛的推广应用。经农业部鉴定，Ⅱ优7954糙米率、精米率、碱消值3项指标达优质米一级标准，而直链淀粉含量偏高，约为25%，达优质米二级标准[6]，仍有遗传改良的空间。对其Wx基因测序结果表明，该基因第1内含子剪切供体位点为G，可能是造成直链淀粉含量偏高的重要因素。93-11是另一个成功用于我国杂交稻两优培九父本的重要籼稻品种[7]，该品种的品质主要指标达农业部颁发的一级优质米标准，其中直链淀粉含量约为17%。对93-11中Wx基因测序结果表明，该基因第1内含子剪切供体位点为T。本研究利用浙恢7954和93-11Wx基因第1内含子剪切供体位点间的多态性，通过分子标记辅助选择的方法，将来源于93-11的Wx等位基因导入浙恢7954，获得了直链淀粉含量下降至18%左右的改良材料，大大提高了受体材料的食用品质。改良后的浙恢7954可作为亲本用于今后高产优质杂交组合的选育。

1 材料与方法

1.1 试验材料

浙恢7954作为改良的受体亲本，93-11作为改良的供体亲本。水稻材料在夏季和冬季分别种植于浙江省农业科学院杭州海宁基地和海南陵水基地，每行6株，植株间隔20 cm。

1.2 叶片基因组DNA的提取

基因组DNA提取参照Murray等[8]的方法进行。

1.3 PCR及AccⅠ酶切反应

参照蔡秀玲等[5]的方法并做适当修改。所用上游引物为Wx-AccI-F:5′-GCTTCACTTCTCTGCTTGTG-3′，下游引物为Wx-AccI-R:5′-CATGATTTAACGAGAGTTGAAC-3′。PCR体系为：2 ×TaqMaster Mix 10 μL，Wx-AccI-F和Wx-AccI-R各20 pmol，DNA模板1 μL，加无菌ddH2O补足到20 μL。PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

酶切反应采用NEB的产品试剂，每20 μL酶切体系加入：AccⅠ酶2 U，CutSmart Buffer 2 μL，PCR扩增产物10 μL，加无菌ddH2O补足到20 μL。37 ℃酶切1 h。酶切产物用2%的凝胶100 V电泳20 min。

1.4 谷粒外观性状的测量

采用万深SC-E型大米外观品质检测分析系统，测量谷粒的粒长、粒宽以及长宽比等性状，每次300粒，重复3次。取1 000粒谷粒使用METTLER TOLEDO公司的PL303101千分之一天平测量千粒重，重复3次。

1.5 谷粒加工品质的测定

根据国标GB1350—2009的方法测定种子的精米率和整精米率。

1.6 直链淀粉含量的测定

参照Juliano等[9]的方法做适当修改，具体方法为：谷粒去壳、脱糙，磨成粉，过100目筛，37 ℃过夜烘干。称取25 mg样品粉末，加入0.5 mL无水乙醇，加4.5 mL 1 mol·L-1的NaOH，沸水浴至粉末全部溶解。加水定容至50 mL，混匀。吸取2.5 mL，加入25 mL水，加0.5 mL 1 mol·L-1的乙酸，加入I-KI试剂0.5 mL，定容至50 mL，放置10 min，混匀，在620 nm处测光密度。同期的空白对照配置为：加入225 μL 1 mol·L-1的NaOH，加入25 mL水，加入1 mol·L-1乙酸0.5 mL，加入0.5 mL的I-KI试剂，定容至50 mL，使用BeckMan Coulter DU730分光光度计测量620 nm处的吸光度。标准曲线的绘制：在中国水稻研究所购得淀粉标样，37 ℃过夜烘干，称取25 mg，加入0.5 mL无水乙醇，加4.5 mL 1 mol·L-1的NaOH，沸水浴至粉末全部溶解。后续步骤和样品步骤相同。

1.7 稻米食味品质的评测

选择来自全国各地的志愿者20名，志愿者根据自己的口味喜好盲评打分，满分10分。

1.8 SNP分型方法

采用Qiagen核酸提取试剂盒从水稻叶片中提取基因组，经RNA酶消化，确保DNA浓度≥50 ng·μL-1，总体积≥20 μL，D260/D280为1.8～2.1。将提取的DNA交由深圳市作物分子设计育种研究院做RiceSNP9K芯片扫描，平均每50 Kb约有1个SNP。芯片扫描结束后，分别对浙恢7954 vs L2和浙恢7954 vs L9进行了全基因组差异分析，并绘制了L2和L9的染色体重组图谱。

2 结果与分析

2.1 亲本浙恢7954、93-11中Wx基因型的鉴定及其种子直链淀粉含量

分别以浙恢7954和93-11的基因组DNA为模板，利用引物Wx-AccI-F、Wx-AccI-R进行扩增，获得目的Wx基因片段。测序结果表明：浙恢7954中Wx基因第1内含子供体+1位点为G，93-11中Wx基因第1内含子供体+1位点为T。用同样的引物进行PCR-AccI分析，结果如图1所示，该对引物PCR扩增Wx基因产物大小为458 bp。GG型Wx基因(浙恢7954)PCR扩增产物经过AccⅠ酶切后，会形成2个大小分别为57和401 bp的片段，而TT型Wx基因(93-11)的PCR扩增产物无法被AccⅠ有效酶切，两者之间的差异可用2%的凝胶电泳区分。上述结果表明，浙恢7954与93-11的Wx基因第1内含子确实存在多态性(图1)，PCR-AccI分子标记可用于区分这一多态性。

分别对浙恢7954、93-11成熟种子的直链淀粉含量进行了测定，结果显示，浙恢7954的直链淀粉含量为24.8%，93-11的直链淀粉含量为16.8%(图3)，表明GG型水稻的直链淀粉含量明显高于TT型。

2.2 PCR-AccI分子标记辅助育种

如图2所示，以浙恢7954为母本，93-11为父本，先经过1次杂交，杂交后代与浙恢7954回交5次。每次回交前用PCR-AccI分子标记检测Wx基因的基因型，选择GT型单株与浙恢7954回交，BC5F1自交1代，F2群体再用PCR-AccI分子标记检测Wx基因的基因型，筛选TT型单株(图2)。2016年夏季，在大田种植多份TT型改良株系及单株，筛选株型、生育期等各项综合指标与受体亲本浙恢7954较一致的TT型株系4个，并对其直链淀粉含量进行了测定。结果表明，所选的4个TT型株系的直链淀粉含量均与供体亲本93-11相近(图3)。本文选择其中2个株系L2和L9为代表(直链淀粉含量分别为17.1%和19.5%)，进行下一步分析。

1～8分别为回交BC5F2群体的不同单株；M为DNA Marker1-8， BC5F2 progeny; M， DNA Marker图1 PCR-AccI分析Fig.1 PCR-AccI analysis

图2 分子标记辅助育种策略Fig.2 Strategy of molecular marker associated breeding

图3 各水稻品种的直链淀粉含量Fig.3 Determination of amylose content of different rice varieties

2.3 谷粒的粒型和千粒重

粒型是一个与水稻产量、品质都息息相关的重要性状。对L2、L9和2个亲本的粒长、粒宽、长宽比及千粒重进行了测定，结果如图4所示。亲本93-11的长宽比和千粒重较浙恢7954大，说明2个亲本在粒型和千粒重上存在着明显差异。L2和L9在粒型和千粒重上与浙恢7954非常接近，与93-11存在着明显差异。

2.4 精米率和整精米率

整精米率是最重要的稻米加工品质，与直链淀粉含量、食味品质和垩白度并列为稻米4项定级指标。L2和L9的精米率分别达到89.8%和88.4%，整精米率分别为87.0%和83.1%，与浙恢7954非常接近(图5)。而供体亲本的93-11的整精米率相对较低，这与其本身的粒长较长、长宽比较大有关。L2和L9的整精米率高，说明L2和L9与浙恢7954一样，具有优良的加工品质。

2.5 稻米的食味品质

对稻米的食味品质进行盲评打分，新品种的综合评分为7分，接近于93-11的7.4分，浙恢7954仅4.8分。说明在蒸煮品质上，改良的新品种相对于浙恢7954有较大提高。

2.6 浙恢7954改良系的全基因组背景扫描

通过SNP分型比较，对浙恢7954 vs L2和浙恢7954 vs L9进行了全基因组差异分析，并绘制出L2和L9的染色体重组图谱(图6)。结果表明，L2和L9的Wx基因所在的6号染色体1.8 Mb处都有93-11片段导入，证明这2个改良品种的TT型Wx基因确实来自于93-11。与此同时，除了Wx位点所在片段外，L2和L9在其他染色体上也分别有不程度的93-11片段导入。

图4 谷粒的粒型和千粒重Fig.4 Grain shape and thousand-grain weight

图5 谷粒的精米率和整精米率Fig.5 Measurement of head rice rate and milled rice rate

A，L9、L2、浙恢7954和93-11的全基因组关联分析；B，浙恢7954与L9主要染色体SNP位点差异；C，浙恢7954与L2主要染色体SNP位点差异A， Genome-wide association study among improved varieties and their parents; B， SNP-typing between ZH7954 and L9; C， SNP-typing between ZH7954 and L2图6 浙恢7954改良系的全基因组检测Fig.6 Genome-wide association study of ZH7954 improved varieties

L2和L9来自浙恢7954的遗传背景比重分别为93.7%和93.4%。L2和L9的相同点为，在1号、2号、5号和10号染色体上，两者都为浙恢7954纯合遗传背景；不同点为，L2的93-11导入片段主要集中在3号、6号、9号、11号和12号染色体上，而L9的93-11导入片段主要集中在6号、7号、8号和9号染色体上。

3 讨论

直链淀粉含量高低是决定稻米品质的关键因素之一。传统育种方法改良这一性状时，需要在分离群体中对收获的种子进行直链淀粉含量测定，耗时费力，效率低下。究其原因，一方面，由于水稻种子是双受精的产物，胚乳细胞受三倍体基因型的控制。另一方面，与株高等其他性状的遗传不同，品质性状在杂交F1或其他杂合体植株上结的不同种子间存在着遗传分离与基因剂量效应[10]。因此，用常规育种方法进行品质性状改良就显得较为繁琐，这也是目前水稻品质改良落后于其他性状改良的主要原因之一。而利用分子标记辅助选择的方法改良稻米直链淀粉含量有以下优点：首先，该分子标记所检测的Wx第1内含子供体+1位的多态性，是决定不同水稻品种直链淀粉含量的重要遗传因素。其次，通过检测植株的基因型来预知成熟种子中直链淀粉含量的高低，可避免繁琐的品质测定工作。最后，以单株为单位，在营养生长期即可预选单株作为杂交或继续回交的亲本，减少了盲目性，也无需等待植株结籽后再测定直链淀粉的表型，避免了遗传分离与基因剂量效应的影响，可以大大提高育种效率。

浙恢7954是浙江省农业科学院自主培育的杂交水稻恢复系，它产量高，配合力强，株型、穗型、开花习性等综合性状优异，由其选育的II优7954、协优7954、钱优1号等杂交组合均获得国家新品种审定。从2000年至今，上述3个杂交组合在全国推广面积达360万hm2，总计增收效益36亿元。近年来，随着高产优质水稻新品种的不断呈现，浙恢7954在水稻品种的竞争中优势逐渐丧失。即便如此，但就其稳产性和配合力而言，浙恢7954所配组合如今仍有竞争力。因此，很有必要在保留浙恢7954其他优异性状的前提下，通过定向改良其食味品质，用改良型浙恢7954来延续原浙恢7954杂交组合的生命力，进一步挖掘浙恢7954的经济和社会价值。本文利用水稻Wx基因的PCR-AccI分子标记，将9311的Wx等位基因(Wxb)导入浙恢7954中，获得直链淀粉含量下降至约18%的TT型浙恢7954。从种子的粒长、粒宽、千粒重等指标来看，TT型浙恢7954的2个株系L2和L9的性状更接近受体亲本浙恢7954。而从口感测定的结果来看，TT型浙恢7954的口感明显改善，综合食味评分更接近供体亲本93-11。通过SNP分型技术对L2和L9遗传背景进行研究，发现2个品系的主要遗传背景有93%来自于浙恢7954。推测L2和L9中控制浙恢7954粒型、千粒重、精米率和整精米率绝大多数主效位点都坐落在这93%的基因组内，而位于第6号染色体上控制直链淀粉含量的主效位点Wx，来自于供体亲本93-11。虽然L2和L9还有7%的遗传背景来自于93-11，但考虑到93-11本身也是性状非常优异的品种，这些导入的片段对于L2和L9来讲，成为遗传累赘的可能性较小。接下来，将对这些改良型株系的杂交配合力、产量等性状进行测定，以期选育出高产优质的杂交稻亲本及其杂交组合。

作为第3代分子标记技术的SNP具有数量多、遗传稳定等优点。而SNP芯片技术的发展则解决了传统SNP检测方法的数量少、效率低等缺点，可以快速、精确地分析出植物的全基因组遗传图谱，在构建作物遗传图谱方面具有其特有的优势。近10年来，随着技术和资源的发展，在基因组研究水平上发展出来的现代植物育种技术被称为基因组育种，基因组育种可以让育种人员更直观地了解育种过程中植株的遗传背景，方便其选育出理想的基因型和表型材料，因而具有广泛的应用前景。

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(责任编辑 侯春晓)

Improving rice quality of ZH7954 by molecular marker-assisted selection

NIU Kaimeng1，2， XU Junbo2， ZHONG Liang2， WANG Hua2， ZHU Ying2，*

(1.CollegeofChemistryandLifeScience，ZhejiangNormalUniversity，Jinhua321004，China; 2.StateKeyLaboratoryBreedingBaseforZhejiangSustainablePestandDiseaseControl，InstituteofVirologyandBiotechnology，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China)

Zhehui7954 (ZH7954) is an elite restorer line with high combining ability for three-lineindicahybrid rice production. However， the amylose content of ZH7954 was high (25%)， which resulted in poor eating and cooking quality. Improvement of rice quality of ZH7954 was hard to achieve by using traditional breeding strategies. In this study， a codominant molecular marker named PCR-AccI was developed based on the G/T SNP at the first intron splicing site of riceWxgene which mainly determines the amylose biosynthesis in rice endosperm. Here， an elite parental line 93-11 with intermediate AC (17%) and T-typeWx(calledWxb) were used as donors. Two lines L2 and L9 were obtained with intermediate AC but similar phenotype to ZH7954 by backcross and molecular marker-assisted selection. Both of them had better eating and cooking quality than receptor line ZH7954， while the appearance quality， such as grain shape， grain weight and milled rice rate were almost identical to ZH7954. These results suggested that the quality of ZH7954 was successfully improved through combining the traditional breeding and marker assisted selection. Data from SNP-typing showed that less than 7% of genome from 93-11 was integrated to ZH7954 in both L2 and L9. The combining ability would be further tested and such intermediate lines might be the valuable materials to generate elite restorer line with high yield and good quality in the future.

ZH7954; amylose content;Wxgene; marker-assisted selection; SNP

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.08.01

2017-03-09

科技部国家重点研发计划(2016YFD0100900)；浙江省自然科学基金委杰出青年基金项目(LR14C02001)

牛凯萌(1992—)，男，山东滨州人，硕士研究生，研究方向为稻米品质改良与分子育种。E-mail: niukaimeng47@163.com

*通信作者，朱英，E-mail: yzhuzaas@163.com

S511

A

1004-1524(2017)08-1227-07

牛凯萌， 徐俊波， 钟亮， 等. 利用分子标记辅助选择改良浙恢7954的稻米品质[J]. 浙江农业学报， 2017， 29(8): 1221-1227.