吲哚菁绿金纳米笼的制备及体外抗肿瘤活性研究Δ

俞燕娜，李方舟，朱 浩，沈园园（上海交通大学药学院，上海 200240）

吲哚菁绿金纳米笼的制备及体外抗肿瘤活性研究Δ

俞燕娜＊，李方舟，朱 浩，沈园园#（上海交通大学药学院，上海 200240）

目的：制备吲哚菁绿金纳米笼（ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM），研究其体外抗肿瘤活性。方法：使用多元醇还原法制备银纳米立方体（AgNC）作为模板，通过离子置换反应制备金纳米笼（AuNC）。对AuNC形貌、粒径及近红外（NIR）光热性质进行表征。使用有机溶剂挥发法制备装载ICG、1-十四醇（PCM）、表面修饰生物素聚乙二醇巯基（Biotin-PEG-SH）的ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM，检测其粒径、多分散系数（PDI）、载药量，考察其在37、40℃下180 min内的体外累积释放度（Q）。以耐阿霉素人乳腺癌细胞（MCF-7/ADR细胞）为研究对象，采用MTT法考察ICG、ICG/PEG-AuNC-PCM、ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM的抗肿瘤活性，计算半数抑制浓度（IC50）。结果：AuNC为立方体，粒径为60 nm左右，具有良好的光热性质。ICG/Biotin-PEG-AuNCPCM的粒径为（105±2.8）nm，PDI为0.261±0.02（n＝3）；载药量为1.34×108g/molAuNC；37℃下Q180min约为10%，40℃下Q20min约为80%。ICG、ICG/PEG-AuNC-PCM、ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM对MCF-7/ADR细胞的IC50分别为95.2、29.3、16.1 μg/mL。结论：成功制得ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM，其对MCF-7/ADR细胞的抗肿瘤活性强于ICG。

金纳米笼；吲哚菁绿；光热性质；抗肿瘤活性

光动力治疗是一类利用光敏剂进行非入侵性肿瘤诊断和治疗的新方法[1-2]，其机制主要是通过特定波长的激光照射光敏剂，激发其于周围的氧分子进行能量/电子转移，产生具有细胞毒性的活性氧自由基，从而引起肿瘤细胞的凋亡及坏死。吲哚菁绿（ICG）是目前唯一被美国FDA认证的近红外（NIR）染料[3-5]。有文献报道ICG具有光动力学性质，亲水性的特征使其能很好地在生物体内分布，且被强穿透力的NIR光激发后能产生活性氧，进而发挥光动力疗效杀死肿瘤细胞[6-7]。因此，ICG被认为是十分有潜力的光敏剂之一。

金纳米笼（AuNC）是一类新型的通过调控合成过程中氯金酸（HAuCl4）加入量，得到NIR区不同局域表面等离子共振（Localized surface plasmon resonance，LSPR）峰的纳米载体[8-10]。其独特的空心内部及多孔壁特征能有效地封装药物，利用其光热性质，通过局部NIR光照，使AuNC周围温度升高，一方面高温杀死肿瘤细胞，起到光热治疗的效果[11]，另一方面通过引入温敏性相变材料从而控制药物的释放。1-十四醇（PCM）是常见的相变材料，其相变温度为38～39℃，仅稍高于人体正常体温，且无毒、无腐蚀性。因此，PCM可作为AuNC的“门卫”，有效地控制药物分子的释放[12-14]。

本研究将ICG与PCM物理混合后共同封装于AuNC内，当体系温度低于PCM相变温度时，ICG能稳定地存在于AuNC内部；通过808 nm NIR对体系进行照射，AuNC由于光热效应导致周围温度升高，当温度达到PCM相变温度时，PCM从固态转变为液态，从而使ICG从AuNC内部释放出来，发挥光动力治疗，起到光热/光动力联合治疗的效果。此外，在AuNC表面进行表面修饰生物素聚乙二醇巯基（Biotin-PEG-SH）修饰，可增加载体在水中的分散性，有效地靶向肿瘤细胞，增加药物的抗肿瘤效果。现将相关内容报道如下。

1 材料

1.1 仪器

HC-2066高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；JEM-2010透射电镜（日本Jeol公司）；Zatasizer Nano S动态光散射仪（英国Malvern公司）；LE-LS-808-2000TFCA 808 nm高温激光器、LENS-808CC-A5 808 nm光纤激光连接器（深圳欧立光电技术有限公司）；Varioskan Flash酶标仪（美国Thermo公司）；BD LSRGortessa流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2 药品与试剂

硝酸银（AgNO3）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）（美国Sigma-Aldrich公司，批号：MKBX7704V、MKBN3006V）；硫化钠九水合物（Na2S·9H2O）、PCM[阿拉丁试剂（上海）有限公司，批号：H1527014、B1502036]；HAuCl4·4H2O（国药集团化学试剂有限公司，批号：20160321）；ICG原料药[梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，批号：8SHBJ-CG，纯度：99%]；聚乙二醇巯基（PEG-SH）、Biotin-PEG-SH（重均分子量：2 000）（北京键凯科技股份有限公司，批号：H20150909、20160419BL02）；1640培养基（美国Gibco公司，批号：1786043）；MTT、胰酶、胎牛血清（FBS）（上海索莱宝生物科技有限公司，批号：303H0510、20150623、140716）；活性氧检测试剂盒（南京碧云天生物技术有限公司，批号：S0033）；其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3 细胞

耐阿霉素人乳腺癌MCF-7/ADR细胞（中国科学院上海药物研究所）。

2 方法与结果

2.1 AuNC的制备

制备银纳米立方体（AgNC）作为模板。调节磁力搅拌油浴锅的转速为300 r/min，温度为150℃。移取6 mL乙二醇于25 mL反应瓶中，预热1 h后，在溶液中加入200 μL Na2S溶液，随后加入3 mL PVP和1 mL AgNO3，继续反应15 min，观察颜色由黄色变为红褐色继而变为不透明的灰绿色后停止反应，冷却至室温（现用现配）。用丙酮（丙酮的体积为反应液的1倍）冲洗反应液并以6 800×g离心20 min分离，弃上清液。产物用超纯水超声重分散，重复洗涤3次，将终产物AgNC分散到4 mL超纯水中，4℃下密封避光保存。通过AgNC与HAuCl4的置换反应制备AuNC[8]：磁力搅拌下，取AgNC 100 μL加入到5 mL超纯水溶液（含1 g/L PVP）中，加热至微沸，10 min后，将0.1 mmol/L HAuCl4溶液用注射泵以0.75 mL/min的速率注入反应液中，直至反应液的紫外吸收峰位于800 nm为止。反应液中加入NaCl至饱和，1 400× g离心30 min，所得沉淀用超纯水超声重分散，重复洗涤3次，将最终产物AuNC超声分散于超纯水中，4℃下密封避光保存。

2.2 AuNC的形貌

使用透射电镜观察AgNC和AuNC的形貌。AgNC和AuNC的透射电镜图见图1。

图1 AgNC和AuNC的透射电镜图（×900 000）Fig 1 Transmission electron micrograph of AgNC andAuNC（×900 000）

由图1显示，AgNC形貌均一、棱角分明，粒径在50 nm左右。AuNC为立方体，粒径稍大于AgNC，约为60 nm，可见明显的中空结构及孔洞，壁厚约为8 nm，孔径约为6 nm。

2.3 AuNC的光热性质

取浓度为37.5 pmol/L的AuNC溶液200 μL于96孔板，分别用0.5、1.0、1.5 W/cm2功率的NIR对其光照，考察光热性质，记录每分钟AuNC溶液温度的变化。不同功率NIR光照下AuNC溶液的温度-时间曲线见图2。

图2 不同功率NIR光照下AuNC溶液的温度-时间曲线Fig 2 Temperature-time curve of AuNC solution under different powers of NIR illumination

由图2可知，光照功率越大，溶液温度变化的速度越快。从照射开始至5 min时，温度上升较快，此后温度变化较小，基本达到平衡。当光照功率为1.5 W/cm2时，照射10 min后，AuNC溶液的温度达到40℃以上，超过PCM的相变温度。

2.4 ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM的制备

称取10 mg PEG-SH混合物（PEG-SH与Biotin-PEGSH之比为4∶1）与10 mL AuNC（浓度约为1 nmol/L）在氮气保护下，冰浴中搅拌反应24 h，8 390×g离心10 min。取沉淀，5 mL超纯水复溶，洗涤2次，除去未接上的PEG，得到Biotin-PEG-AuNC，4℃下密封避光保存。取制备的Biotin-PEG-AuNC 1 mL（浓度为1 nmol/L），8 390×g离心10 min，取沉淀用1 mL甲醇复溶，置于反应瓶中，加入100 mg PCM，90℃油浴中加热至融化；待温度降至40℃加入1 mL ICG（2 g/L）的甲醇溶液，搅拌使其分散均匀，50℃下完全挥干甲醇。上述混合物于40℃油浴中继续加热2 h，加入1 mL热水使混合物分为2相，一相为PCM/药物的混合物，另一相为载有PCM/药物的AuNC和水（由于AuNC表面的亲水性，所以优先提取出来）。PCM由于不溶于水很难扩散到水中，从而导致PCM/药物仍然有效地保留在AuNC内。最后，通过离心获取ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM，沉淀重新分散在1 mL超纯水中，反复洗涤3次除去游离的药物，终产物于4℃下密封避光保存。

2.5 ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM的表征及载药量测定

使用粒径仪检测AgNC和AuNC、Biotin-PEG-AuNC和ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM的粒径变化。4种样品的粒径分布情况见图3。

图3 4种样品的粒径分布情况Fig 3 Distribution of particle sizes of 4 samples

由图3可知，4种样品中ICG/Biotin-PEG-AuNCPCM的粒径最大，为（105±2.8）nm，多分散系数（PDI）为0.261±0.02（n＝3）。将ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM用甲醇溶解超声后，完全释放所装载的药物ICG，通过紫外分光光度计测定和回归方程计算得到载药量为1.34×108g/molAuNC。

2.6 体外释药行为考察

取0.5 mL ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM溶液，用PBS（pH 7.4）为释放介质稀释至2.5 mL，于37、40℃恒温水浴，100 r/min振荡进行释放试验。分别于5、10、20、30、40、60、80、100、120、150、180 min离心取1 mL上清，并加入新鲜释放介质重悬。采用紫外分光光度计测定释放液中ICG浓度，计算累积释放度。37、40℃下ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM中ICG的释放曲线见图4。

图4 37、40℃下ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM中ICG的释放曲线Fig 4 Release curves of ICG in ICG/Biotin-PEGAuNC-PCM under 37，40℃

由图4可知，37℃下，180 min后，ICG/Biotin-PEGAuNC-PCM中ICG的累积释放度约为10%，说明绝大部分药物仍封装在AuNC内部；40℃下，药物迅速释放，20 min后，ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM中ICG的累积释放度约为80%，说明药物大部分从AuNC中释放出来了。由此提示，体外释药行为具有良好的温度响应性。结合AuNC的光致热效应，可以通过NIR照射使AuNC溶液温度升高从而控制药物释放。

2.7 体外细胞毒性

MTT法测定ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM对MCF-7/ADR细胞的细胞毒性。将MCF-7/ADR细胞以5 000个/孔的密度接种于96孔板，培育过夜。分别将100 μL含有1～100µg/mL系列浓度的ICG、ICG/PEG-AuNCPCM、ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM溶液加至细胞培养板孔中，作用8 h后，给予NIR（1.5 W/cm2）照射20 min，继续培养至24 h。弃培养基，PBS洗涤3次，每孔加入0.5 mg/mL的MTT溶液200 μL，继续避光孵育4 h后终止培养，弃上清，每孔加入200 μL二甲基亚砜溶液，摇床轻摇10 min使甲臜晶体充分溶解。用酶标仪测定570 nm波长处的光密度，计算细胞抑制率和半数抑制浓度（IC50）。3种样品对MCF-7/ADR细胞的抑制率-质量浓度曲线见图5。

图5 3种样品对MCF-7/ADR细胞的抑制率-质量浓度曲线Fig 5 Inhibition rate-mass concentration curves of 3 samples on MCF-7/ADR cells

由图5可知，与ICG/PEG-AuNC-PCM、ICG比较，ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM对MCF-7/ADR细胞的抑制率明显增加，ICG、ICG/PEG-AuNC-PCM、ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM对MCF-7/ADR细胞的IC50分别为95.2、29.3、16.1 μg/mL。这表明ICG/Biotin-PEG-AuNCPCM通过Biotin修饰增加了靶向性，结合ICG的光动力治疗与AuNC的光热治疗特性有效地增加了其对细胞的杀伤作用。

3 讨论

笔者前期研究中，以水为空白对照，利用808 nm激光发射器，考察了1.25、2.5、5µg/mL的ICG溶液在1.5 W/cm2功率的NIR光照下4 min内的温度变化。结果发现，随着ICG质量浓度的升高，溶液的温度升高速度越快、增幅越大；光照第2～4分钟范围内，各质量浓度的ICG溶液温度变化均较小，表明已达平台期，说明ICG溶液温度变化的过程是先快后慢。

笔者前期研究中，分别考察了有、无NIR光照下18.75～100 pmol/L Biotin-PEG-AuNC-PCM对MCF-7/ ADR细胞抑制率的影响。结果发现，在无NIR光照下，各浓度的Biotin-PEG-AuNC-PCM对MCF-7/ADR细胞抑制率均小于10%，说明无NIR光照时，载体材料对于肿瘤细胞的毒性较小；在NIR照射下，Biotin-PEGAuNC-PCM的细胞毒性随其浓度的增大而增加，说明Biotin-PEG-AuNC-PCM在NIR光照下，发挥了光热治疗的效果，对MCF-7/ADR细胞有一定细胞毒性。

综上所述，笔者成功制备了以AuNC为纳米载体、装载光敏剂ICG和相变材料PCM的新型NIR刺激响应的ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM，其对MCF-7/ADR细胞的抗肿瘤活性强于ICG。

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Preparation of Indocyanine Green Gold Nanocages and Study on Its in vitro Antitumor Activity

YU Yanna，LI Fangzhou，ZHU Hao，SHEN Yuanyuan（School of Pharmacy，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China）

OBJECTIVE：To prepare the Indocyanine green gold nanocages（ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM），and study its antitumor activity.METHODS：Polyol reduction method was used to prepare silver nanometer cubes（AgNC）as template，ion exchange reaction was used to prepare gold nanocages（AuNC）to characterize its morphology，particle size，near infrared（NIR）light and heat properties.Organic solvent evaporation method was conducted to prepare the ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM loaded with ICG，1-tetradecanol（PCM），surface modification of biotin polyethylene glycol mercapto（Biotin-PEG-SH）.Its particle size，polydispersity index（PDI）and drug loading were detected，and in vitro cumulative release（Q）within 180 min under 37，40℃was investigated.Using adriamycin-resistant human breast cancer cells（MCF-7/ADR cells）as objects，MTT method was used to investigate the antitumor activities of ICG，ICG/PEG-AuNC-PCM and ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM，and half inhibitory concentration（IC50）was calculated.RESULTS：AuNC was cubic with particle size of about 60 nm and good light and heat properties.The particle size of ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM was（105±2.8）nm，PDI was 0.261±0.02（n＝3）.Drug loading was 1.34×108g/mol AuNC，Q180minwas about 10%under 37℃and Q20minwas about 80%under 40℃.IC50of ICG，ICG/PEG-AuNC-PCM and ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM on MCF-7/ADR cells was 95.2，29.3，16.1 μ g/mL，respectively.CONCLUSIONS：ICG/Biotin-PEGAuNC-PCM is successfully prepared，and the antitumor activity on MCF-7/ADR cells is stronger than ICG.

Gold nanocages；Indocyanine green；Light and heat property；Antitumor activity

R943

A

1001-0408（2017）22-3113-04

2017-03-20

2017-05-12）

（编辑：邹丽娟）

国家自然科学基金资助项目（No.81573352）

＊硕士研究生。研究方向：纳米给药体系研究。电话：021-34204793。E-mail：z3yn1991@163.com

#通信作者：高级工程师，硕士。研究方向：分子药剂学和纳米给药体系。电话：021-34204793。E-mail：shenuanyuan@sjtu.edu.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.22.24