APP下载

不同提取方法对柑橘皮总黄酮及其抗氧化活性的影响

2017-09-03吴梅青陈丹李俊雅

中国林副特产 2017年4期
关键词:提取液柑橘黄酮

吴梅青,陈丹,李俊雅

(湘潭医卫职业技术学院,湖南湘潭411102)

不同提取方法对柑橘皮总黄酮及其抗氧化活性的影响

吴梅青,陈丹,李俊雅

(湘潭医卫职业技术学院,湖南湘潭411102)

研究不同提取方法对柑橘皮总黄酮及抗氧化活性的影响。选用碱溶酸沉、回流、超声、微波和水提等5种提取方法,测定5种不同的提取液中总黄酮的含量;采用DPPH、普鲁士蓝两种方法测定其抗氧化活性;并分析总黄酮含量和抗氧化活性之间的关系。在对总黄酮的测定中,结果如下:回流提取法>超声提取法>微波提取法>水提法>碱溶酸沉法,回流提取总黄酮含量大于其它几种方法,与其他3种提取方法进行对比,差异非常明显(P<0.05),而与超声提取比较差异不明显(P>0.05)。抗氧化的结果显示,5种提取方法所得的黄酮提取液均有较强的抗氧化活性;不同提取方法提取柑橘总黄酮抗氧化性的效果依次为:超声提取法>微波提取法>回流提取法>水提法>碱溶酸沉法。相关性分析发现,总黄酮的含量与抗氧化活性呈一定的正相关。结果表明,不同的提取方法会对柑橘黄酮含量以及抗氧化活性产生一定的影响,各提取液中黄酮含量和抗氧化活性之间具有正相关的关系。

柑橘;黄酮;不同提取方法;抗氧化活性

柑橘果实历来是我国传统的中药材,其中的黄酮类物质含量丰富。其黄酮主要存在于柑橘属植物果实的外皮中。研究表明,黄酮类化合物有多重生物学作用,如抗炎抑菌、抗氧化、降血糖、降血脂、抗癌、抗肿瘤及增强免疫力等作用,其安全、无毒,已在医药、食品加工等方面得到广泛应用[1]。近年来国内外有关柑橘黄酮的报道日渐增多,柑橘黄酮以其特有的生理活性逐渐引起人们的重视,目前市场上已有大量以天然黄酮物质作为膳食补充剂制成的各种保健品和食品,柑橘黄酮作为食品添加剂具有广阔的发展前景。本研究以湖南产柑橘皮为研究对象,参考相关文献资料,采用碱溶酸沉法、水提法、回流提取法、超声提取法、微波提取法等5种提取方法提取柑橘中总黄酮,分析不同提取方法对柑橘总黄酮含量及其抗氧化活性的影响,旨在为更加深入研究柑橘黄酮的作用提供科学依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

蜜桔,购买于湖南湘潭某农贸市场,产地为常德石门;芦丁对照品(中国食品药品检定研究院,100080-200707 );二苯代苦味酰基(DPPH)自由基(梯希爱(上海)化成工业发展有限公司);铁氰化钾(广州化学试剂厂);三氯乙酸(国药集团化学试剂有限公司);邻苯三酚(上海迈坤化工有限公司;)无水乙醇; NaOH、Al(NO3)3、NaNO2等为分析纯;超纯水。

1.2 仪器

双光束紫外分光光度计(UV2600,上海天美科学仪器有限公司);分析天平(十万分之一,赛多利斯BP211D);XL-600B多功能粉碎机(永康市小宝电器有限公司);KQ3200DB数控超声波清洗仪(昆山超声仪器有限公司)。

2 方法

2.1 原料预处理

将蜜桔洗涤后剥皮,再蜜橘皮放在50℃烘箱中烘干至恒重。采用多功能粉碎机进行粉碎,过60目筛,放干燥器中,备用。

2.2 芦丁标准曲线的绘制

精密称定芦丁对照品10.90mg置25mL量瓶中,加一定量75%的乙醇溶解,冷却至室温,再加75%的乙醇至刻度,得0.4360mg/mL的芦丁对照品溶液。

精密量取对照品溶液0、1、1.5、2、2.5、3、4mL,分别置25mL容量瓶中,各加75%乙醇补足至5.0mL,各加5%亚硝酸钠溶液1mL,摇匀,静置6min,再加10%硝酸铝溶液1mL,摇匀、静置6min,再4%氢氧化钠试液10mL,再加75%乙醇至刻度,摇匀,静置15min。以空白试剂作对照液,用双光束紫外分光光度计在510nm的波长处测定吸光度,以对照品质量浓度为横坐标,吸光度为纵坐标得到标准曲线,如图1所示。

图1 芦丁标准曲线

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 水提取液的制备。精密称定2.1项下样品约4.0g,置于250mL 圆底烧瓶中,加100 mL 水,直火加热回流提取1h,放冷至约50℃,抽滤,重复提取3次,过滤,合并滤液,放置过夜,沉淀完全,减压抽滤,沉淀用蒸馏水洗涤3次,抽干,将沉淀物转移到表面皿中,于45℃恒温真空干燥至恒重。用75%的乙醇溶解并定容至250mL容量瓶中,备用。平行试验3次。

2.3.2 回流提取液的制备。精密称定2.1项下样品约 4.0g,置250 mL的圆底烧瓶中,加75%的乙醇回流提取3次,提取时间分别为1.0、0.5、0.5 h, 乙醇用量分别为40、30、30mL,合并3次回流提取液,定容至250 mL的容量瓶中,备用。平行试验3次。

2.3.3 碱溶酸沉法液的制备。精密称定2.1项下样品约4.0g,置于干净的烧杯中,加已煮沸的0.4%硼砂水溶液40mL加热至沸腾,并在搅拌条件下加石灰乳调pH值在8~9,并保持该pH值煮沸20min,趁热用4层纱布过滤;药渣同法再操作2次,合并3次滤液,并用浓 HC1调pH值约为3~4,搅拌,放置过夜使沉淀完全,减压抽滤,沉淀用蒸馏水洗涤3次,抽干,将沉淀物转移到表面皿中,于45℃恒温真空干燥至恒重。用75%的乙醇溶解并定容至250mL容量瓶中,备用。平行试验3次。

2.3.4 超声提法液的制备。精密称定2.1项下样品约4.0g,置于100mL的三角瓶中,用75%的乙醇30mL在超声功率250W及超声温度25℃的水浴中提取30min,同法再操作2次,合并滤液,浓缩后得提取液,用75%的乙醇定容至250mL容量瓶中,备用。平行试验3次。

2.3.5 微波提法液的制备。精密称定2.1项下样品约2.0g,置于100mL的三角瓶中,加入40mL的75%乙醇溶液,采用微波辅助提取,微波辐射功率 400W、微波辐射时间 30s×3,趁热过滤,同法再操作2次,合并滤液,回收乙醇,用75%的乙醇定容至250mL容量瓶中,备用。平行试验3次。

2.4 总黄酮含量的测定

精密吸取1mL上述总黄酮提取液置25mL容量瓶中,按2.2项下方法测定510nm处的吸光度,对照标准曲线 ,按照(1)公式计算柑橘皮中总黄酮的含量。

(1)

式中:C为提取物总黄酮含量(mg),V为总样品体积(mL),W为样品重量(g),v为测定的样品体积(mL),N为稀释倍数。

2.5 抗氧化活性的测定

2.5.1 不同方法黄酮提取物对DPPH自由基清除能力的测定。对 DPPH 自由基抗氧化活性的测定参照文献[2-4]方法并稍做修改,方法如下:精密称取 DPPH 标准品 0.0098g,用无水乙醇溶解并定容至 250 mL,配成0.1mol /L DPPH自由基溶液,现配现用。在具塞试管中分别加入2.00mL不同提取方法提取的柑橘皮黄酮提取液,再加入2.00mL 0.1mol /L DPPH自由基溶液, 摇匀,静置 30 min。用2.00mL无水乙醇代替样品和用2.00mL75%的乙醇混合后,用紫外-可见分光光度计在517 nm 处分别测定吸光度值(Aj)。空白对照组是以2.00mL无水乙醇代替样品,用紫外-可见分光光度计在517 nm 处分别测定吸光度(A0)。DPPH自由基的清除率按(2)公式计算:

(2)

2.5.2 不同方法黄酮提取物对Fe3+还原能力的测定。采用普鲁士兰法测定不同方法黄酮提取物还原Fe3+的能力[5]。方法如下:在15mL具塞试管加入不同提取方法浓度不同的提取液1mL后,依次加入磷酸盐缓冲液(C=0.2mol/L,pH6.6)2mL,1%铁氰化钾(K3Fe(CN)6)2mL,混合均匀后于50℃浴中反应20min后迅速冷却,然后分别加入2mL 10%三氯乙酸(TCA),混匀,离心(3000r/min)10min后,取上清液2.5mL,加入2.5mL蒸馏水和0.1%三氯化铁0.5mL,混匀后于700nm处测定其吸光值。反应物吸光度增大说明还原能力增强。

3 结果与分析

3.1 不同提取方法提取柑橘皮黄酮的比较

5种提取方法中柑橘总黄酮的含量见表1。从表1中可以看出回流提取的总黄酮大于其它几种方法,含量为83.34mg/g;其次为超声提取法,含量为68.13mg/g;微波法为 56.42mg/g,水提法为44.76mg/g,碱溶酸沉法最低,为34.12mg/g。回流提取法与超声波提取相比黄酮含量差异不显著(P>0.05),而与水提和碱溶酸沉提取之间黄酮含量差异显著(P<0.05)。以上数据表明,柑橘黄酮易溶于乙醇,醇提法有利于柑橘黄酮的溶出。

表1 5种提取方法所得总黄酮含量比较

3.2 抗氧化活性的测定

3.2.1 不同方法黄酮提取物对DPPH自由基的清除能力。将5种不同提取方法的黄酮提取液按2.5.1的方法测定不同方法提取的提取液对对DPPH自由基的清除作用,结果如图2所示。从图2中可以看出,超声提取液中总黄酮对DPPH自由基清除率最高,为72.62%;碱溶酸沉法提取液中总黄酮对DPPH自由基清除率最低,为40.45%;回流提取液为68.78%;微波提取液为64.72%,水提取液为48.26%。5种提取方法在实验浓度清除效果:超声提取法>微波提取法>回流提取法>水提法>碱溶酸沉法。超声提取液、回流提取液和微波提取液的抗氧化能力与碱溶酸沉提取液和水提液的抗氧化能力相比有显著差异性(P<0.05)。

注:1-碱溶酸沉法,2-超声提取法,3-回流提取法,4-微波提取法,5-水提取法。

3.2.2 不同方法黄酮提取物对Fe3+还原能力的测定。将5种不同提取方法的黄酮提取液按2.5.2的方法测定提取液中总黄酮对 Fe3+的还原能力,结果如图3所示。由图3可以看出,超声提取液中总黄酮对Fe3+的还原能力最高;碱溶酸沉法提取液中总黄酮对Fe3+的还原能力最低。5种提取方法在实验浓度对Fe3+的还原能力:超声提取法>微波提取法>回流提取法>水提法>碱溶酸沉法。超声提取液、微波提取液和回流提取液对Fe3+的还原能力相比较,差异性不显著(P>0.05)。

注:1-碱溶酸沉法,2-超声提取法,3-回流提取法,4-微波提取法,5-水提取法。

3.2.3 不同提取方法黄酮含量与抗氧化活性间的相关关系。采用Excel做统计分析计算相关系数,总黄酮的含量与对DPPH自由基的清除率和对Fe3+的还原能力有一定的相关性,相关系数分别为0.6514和0.8168。而对DPPH自由基的清除率和对Fe3+的还原能力之间有较强的相关性,相关系数达到0.9422。

4 讨论

从测定结果看,不同提取方式柑橘总黄酮的效

率依次为:回流提取法>超声提取法>微波提取法>水提法>碱溶酸沉法;不同提取方式提取柑橘总黄酮抗氧化性的效果依次为:超声提取法>微波提取法>回流提取法>水提法>碱溶酸沉法。不同提取方式总黄酮含量与抗氧化性有一定的相关性。由于不同提取方法破坏决柑橘皮细胞的程度也不相同,其有效成分的含量也不同,造成抗氧化性的能力也不太相同。无论是从有效成分的角度还是抗氧化能力的角度考虑,回流提取法和超声提取法都是比较理想的提取方法。

5种不同方法提取得到的柑橘提取液中,回流提取法对柑橘总黄酮的提取率最高,但是从抗氧化能力方面看,超声取液中总黄酮的抗氧化能力最高,可能与超声波浸提过程中低温提取有利于保护有效成分等优点有关[6]。因此,柑橘黄酮进行提取方法筛选时,要综合考虑黄酮的提取率及其抗氧化活性。

[1]吴梅青,刘捷频,陈丹.柑橘黄酮抗氧化和抗肿瘤作用的研究进展[J].亚太传统医药,2017,173(13):83-85.

[2]李小勇,霍喜东,杨自勇,等.不同方法提取国槐叶黄酮及其抗氧化活性研究[J].食品工业科技,2014,17(35):102-105.

[3]万利秀,肖更生,徐玉娟,等.柑橘皮黄酮纯化前后抗氧化性比较研究[J].食品科学,2011,5(32):87-91.

[4]Zhang Qingfeng, Zhang Zhongrong, Cheung Honyeung. Antioxidant activity of Rhizoma smilacis Glabrae extracts and its key constituent-astilbin[J]. Food Chemistry, 2008,115:297-303.

[5]林瑶,谭冰,韦文荣,等.不同提取法对广金钱草总黄酮抗氧化活性的影响研究[J].右江民族医学院学报,2016,4(38):364-367.

[6]张佳赫,韩丽琴.不同提取方式对葛根总黄酮抗氧化反应的影响[J].安徽农业科学,2010,38(24):13032-13033.

全国优秀农业期刊·北方优秀期刊·吉林省十佳期刊·吉林省一级期刊

国际标准刊号:ISSN 1672-0180 国内统一刊号:CN22-1215/S

●传种菜之经播科技星火引致富之路

●北方地区蔬菜专业期刊信息量大/内容丰富实用/广告精彩绝伦

主要栏目:蔬菜栽培、植物医院、新优品种、保鲜加工、试验报告、工作研究、园林花卉、食用菌专栏、技术创新、菜业咨讯等。

月刊,邮发代号12-151,每期订价10元,总订价120元。

杂志社地址:(130033)长春净月经济开发区千朋路555号

联系人:齐心 13504487898

E-mail:jlshucai@163.com

编辑部电话:0431-2532029

EffectofDifferentExtractionMethodsontheContentofTotalFlavonoidsCompoundanditsAntioxidatantActivityinCitrusPeels

Wu Meiqing, Chen Dan, Li Junya
(Xiangtan Medicine Health Vacational College, Xiangtan,Hunan 411102)

To study the effects of different extraction methods on the content of total flavonoids compound and its antioxidatant activity in Citrus Peels. Flavonoids compound was extracted respectively by alkali-solution and acid-isolation,reflux extraction(RE), ultrasonic extraction(UE), microwave extraction(ME) and water extraction(WE). The total flavonoids content and its antioxidatant activity was determined by UV spectrophotometry. The correlation between flavonoids compound and antioxidatant activity was analyzed. In the determination of total flavonoids, the result was: reflux extraction > ultrasonic extraction > microwave extraction > water extraction> alkali-solution and acid-isolation. The flavonoids content extracted by RE was the highest which showed a significant difference(P<0.05) compared with other methods except UE(P>0.05). The antioxidatant results showed the flavonoids extracts by the five different methods had strong antioxidatant activity. The antioxidant effect of different extraction methods as follows: ultrasonic extraction > microwave extraction >reflux extraction > water extraction> alkali-solution and acid-isolation. There was positive correlation between flavonoids compound and its antioxidatant activity. Flavonoids compound and antioxidatant activity in citrus peels was affected by different extracting methods. There was positive correlation between flavonoids compound and its antioxidatant activity.

Citrus peels;Total flavonoid; Different extraction methods; Antioxidant activity

2017-03-19

湖南省教育厅科学研究项目 (15C1362)

吴梅青(1971-),女,教授,硕士,研究方向:天然药物的研究与应用,E-mail:wmq0519@sina.com。

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2017.04.002

R284.2

:A

猜你喜欢

提取液柑橘黄酮
板栗刺壳提取液对柞蚕丝/锦纶织物的染色
不同桑品种黄酮含量测定
桑黄黄酮的研究进展
柑橘家族
苦参及其提取液中的重金属污染分析及其初步风险评估
亚麻木脂素提取液渗透模型建立与验证
柑橘的秘密
HPLC法同时测定固本补肾口服液中3种黄酮
DAD-HPLC法同时测定龙须藤总黄酮中5种多甲氧基黄酮
山香圆叶提取液纯化工艺的优化