纳米金结合恩度抑制小鼠黑色素瘤肺转移*

李 鑫， 潘运龙， 覃 莉， 李 伟， 吴 秀， 杨文德， 潘 璠

(暨南大学附属第一医院胃肠外科， 广东 广州 510630)

纳米金结合恩度抑制小鼠黑色素瘤肺转移*

李 鑫， 潘运龙△， 覃 莉， 李 伟， 吴 秀， 杨文德， 潘 璠

(暨南大学附属第一医院胃肠外科， 广东 广州 510630)

目的： 观察纳米金结合恩度对小鼠黑色素瘤肺转移的影响并探讨其机制。方法: C57BL/6小鼠24只，构建小鼠黑色素瘤B16-F10细胞自发性肺转移模型，随机分为恩度组、纳米金组、纳米金结合恩度组和模型组。成瘤后各组小鼠均经尾静脉注射相应药物0.1 mL(每天1次)。9 d后麻醉小鼠并切取原位肿瘤，继续饲养2周后处死小鼠取肺组织观察转移情况。HE染色观察原位肿瘤坏死情况，免疫染色检测肿瘤CD31、碳酸酐酶IX(CA-IX)、vimentin和闭锁小带蛋白1(ZO-1)的表达。结果: 与模型组相比，药物处理组小鼠的肺转移灶均明显减少，其中纳米金结合恩度组的肺转移抑制率最高，肿瘤坏死明显减少，肿瘤中CD31、CA-IX和vimentin的表达量显著降低，ZO-1的表达量显著升高。结论: 与单用恩度或纳米金相比，纳米金结合恩度可明显抑制小鼠黑色素瘤肺转移，其机制可能为使肿瘤新生血管减少及血管正常化，改善肿瘤缺氧，从而抑制肿瘤上皮-间充质转化，使肿瘤细胞间紧密连接增加而侵袭性减低。

纳米金； 恩度； 黑色素瘤； 肿瘤转移； 上皮-间充质转化

转移是恶性肿瘤的基本生物学特征，90%以上的癌症患者死于肿瘤转移[1]。血管生成是肿瘤生长、转移的必要条件，抗肿瘤血管生成治疗是一种有效的治疗方法[2]，但过度抗血管生成会加重肿瘤微环境的缺氧状态，降低放化疗疗效[3-4]。因此Jain[5]提出了肿瘤血管正常化理论，即合理运用抗肿瘤血管生成药物可以重新恢复促血管生成因子和血管生成抑制因子之间的平衡，使原来扭曲异常的肿瘤血管系统趋于正常，并能改善肿瘤微环境。重组人血管内皮抑制素恩度(Endostar)为抗肿瘤血管生成药物，小剂量应用可使肿瘤血管短暂趋于正常，改善肿瘤缺氧[6-7],但恩度特异性不高且具有潜在的心脏反应、胃肠道反应等不良反应。纳米金(gold nanoparticles，AuNPs)是直径介于1～100 nm的金颗粒，具有生物相容性好、组织渗透性强、表面易于修饰等优点[8]，因此，常用来作为药物靶向输送的载体[9-11]。本课题组前期研究表明，AuNPs本身具有抗肿瘤血管生成、使肿瘤血管正常化作用[12-15]；将纳米金与恩度结合形成复合体，可靶向输送恩度至肿瘤组织而提高浓度，使肿瘤血管产生一个正常化时间窗(第4～12天)，改善肿瘤微环境[16]。本实验利用小鼠黑色素瘤自发性肺转移的动物模型研究纳米金结合恩度对肿瘤血行转移的影响，并通过免疫染色检测肿瘤血管密度、缺氧程度及黑色素瘤细胞波形蛋白(vimentin)、闭锁小带蛋白1(zonula occludens-1，ZO-1)的表达，探讨其影响转移的机制。

材 料 和 方 法

1 动物

根据《导游人员管理条例》第二条，导游是指通过正规渠道获得导游证，经旅行社派遣，在旅行过程中为游客提供旅游向导、景点讲解等旅游服务的人员。作为典型的边界跨越者，导游在理解、过滤和解读往来于旅行社及其外部游客间的信息和资源的过程中担任关键角色。该职业具有以下工作特征：（1）高度的独立性。旅游过程中的绝大部分事务都需要导游全权负责；（2）脑力与体力高度结合。旅途中，导游既需要不断地思考，还需要健康强壮的身体支撑一系列体力活动；（3）面对复杂多样的事物。包括复杂的服务对象、多元的游客需求、复杂的人际交往等；（4）文化传播的载体。导游肩负着传播文化的任务，需要在不同民族、不同地域文化中构建沟通的桥梁。

SPF级C57BL/6小鼠24只，雌雄不限，8周龄，23～25 g，由暨南大学实验动物中心提供。小鼠黑色素瘤B16-F10细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。

2 主要试剂

4 统计学处理

3.5 免疫染色检测原位肿瘤中血管密度、缺氧和肿瘤转移相关分子的表达 原位肿瘤石蜡切片，按福州迈新生物技术开发公司提供的SP法进行免疫组化的检测。抗 CD31标记血管内皮细胞，观察肿瘤组织血管密度。抗 CA-IX检测肿瘤组织缺氧情况。抗 ZO-1标记肿瘤细胞间的紧密连接蛋白。抗 vimentin标记恶性黑色素瘤的细胞骨架蛋白。应用ImageJ图像处理软件对图片中的阳性表达进行量化分析。

3 主要方法

3.1 配制纳米金-恩度复合体溶液 参考本课题组前期发表文献[16]中的方法制备纳米金-恩度复合体(AuNPs-Endostar)溶液：按照溶液体积AuNPs∶Endostar=4∶1取Endostar加入AuNPs溶液中振荡混匀，放入4℃冰箱避光孵育12 h，期间每隔2 h振荡混匀。然后加入等体积的甲氧基聚乙二醇硫醇振荡混匀，继续避光孵育4 h，然后以12 000 r/min的转速离心15 min，弃去上清液，底部的聚沉物即为纳米金-恩度复合体，以适量生理盐水震荡溶解后用于动物实验。

3.2 构建小鼠黑色素瘤自发性肺转移模型 消化收集对数生长期B16-F10细胞，重悬于PBS中(5×109～1×1010/L)，接种于C57BL/6小鼠后肢足垫(皮下注射50 μL)。将荷瘤小鼠随机分为4组，每组6只，按以下方案给予处理：纳米金结合恩度组用AuNPs-Endostar复合体溶液；恩度组用等体积Endostar溶液；纳米金组用AuNPs溶液；模型组用生理盐水。肿瘤生长至120 mm3左右开始给药，按照恩度5 mg/kg的剂量稀释相应溶液为0.1 mL，尾静脉注射(1次/d)。9 d后用戊巴比妥麻醉小鼠，切除后肢，分离原位肿瘤以多聚甲醛固定。2周后给予小鼠安乐死，取肺组织多聚甲醛固定。

在俄罗斯，因主观条件致婚姻无效的，受害的一方可以提起婚姻无效之诉。在我国，受胁迫的一方可以提起婚姻撤销之诉。但是，撤销婚姻可由法院为之，也可由婚姻登记机关为之。不管是婚姻被宣告无效还是被撤销，都产生自始无效的后果。当事人之间的身份关系消灭，但不影响与其子女之间的身份关系。

（一）活动推广。中医学上有一句话，叫“动则生阳”。其中“阳”字指“阳气”。笔者在此望文生义，将其“曲解”变通一下，变为“太阳”，而这里的“太阳”又类似于《三字经》中泛指一切给人带来温暖的事物。“温暖”取其不过炎，亦不过寒，感觉舒适之意。而活动恰恰起到如是作用。尤其对青少年，或者对少年儿童来说。笔者从事管理工作的都江堰市图书馆，正是通过一系列的活动，如“动物绘画展”“科技知识展”等，唤醒孩子们“读”的欲望。“欲”字取其内心想要，既然发乎于心的想要阅读，那“读”的过程自然是一种愉悦身心的乐事，成为阅读通道。

3.3 肺转移的观察 在解剖显微镜下计数肺表面转移瘤结节数，并测量结节的最长径，对结节进行分级(Ⅰ级：直径<0.5 mm；Ⅱ级：直径0.5～1 mm；Ⅲ级：直径1～2 mm；Ⅳ级：直径>2 mm)，并按照以下公式计算总转移数：总转移数=Ⅰ级(结节数)×1+Ⅱ级×2+Ⅲ级×3+Ⅳ级×4；肺转移抑制率(%)=(1-实验组肺转移数/对照组肺转移数)×100%。同时行肺组织石蜡包埋、切片，HE染色后镜下观察肺内转移。

恩度由中国先声药业集团有限公司提供。AuNPs溶液购自上海捷宁生物科技有限公司。DMEM培养基和优质胎牛血清购自Gibco。兔抗鼠CD31、碳酸酐酶IX(carbonic anhydrase-IX，CA-IX)、上皮型钙黏蛋白(epithelial cadherin，E-cadherin)、vimentin和ZO-1单抗购自Abcam。SP试剂盒(通用型)购自福州迈新生物技术开发有限公司。

山地式农村的海拔高差大于100 m，山坡坡度较大，地形地貌极为复杂，是地质灾害频发区。土地资源利用受自然条件影响极大，导致生态功能用地布局散乱，也意味着细碎化程度高。老居民住宅零散，多分布于道路两侧及两侧山坡相对平缓处，道路一般沿等高线修建。该类乡村受地形地貌等影响，区内经济水平普遍较低，与此相反的是该区域的生态系统保持较好，具有较高的生态功能，在规划过程中仅需考虑水土流失及改善居民生活条件就可以实现生态网络的建立。

（3）混合感染率。调查的80只羊中多为混合感染，其中没有感染球虫的感染率为16.25%（13/80），感染1种球虫的为12.50%（10/80），混合感染2种球虫的为12.50%（10/80），混合感染3种球虫的为26.25%（21/80），混合感染4种球虫的为12.50%（10/80），混合感染5种球虫的为11.25%（9/80），混合感染6种球虫的为6.25%（5/80），混合感染7种球虫的为1.25%（1/80），混合感染8种球虫的为1.25%（1/80）[3]。

3.4 HE染色观察原位肿瘤的组织学变化 各组原位肿瘤经多聚甲醛固定后，脱水、石蜡包埋、切片，行HE染色观察肿瘤组织坏死情况。

用SPSS 16.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni检验， 以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

3 HE染色观察原位肿瘤的坏死情况

①心理行为小组确立:为患者在进行护理时,需确立心理行为护理小组,小组当中包括有一名主治医生,一名责任护士和三名护理人员。责任护士担任组长,护理前需邀请专业的心理行为干预专家进行培训,主要内容需围绕心理干预方法、沟通的技巧、干预的内容等逐渐提高护理人员的综合能力,帮助护理人员深化服务意识。做好对于患者的、生理和心理状态的评估,了解患者的护理干预的需求,并在此基础之上,根据患者的实际状况,为患者制定针对性的干预方案,主动为患者进行详细的解释,提高患者护理的依从性。

如表1所示，与模型组相比，各处理组小鼠肺转移灶数量明显降低(P<0.01)；与AuNPs组和Endostar组相比，AuNPs-Endostar组肺转移灶明显减少(P<0.05),提示AuNPs和Endostar均可抑制小鼠黑色素瘤的转移，AuNPs-Endostar较单独用药可显著提高转移抑制率。图1为各组小鼠肺组织大体图片，图2为肺组织HE染色图片，可见AuNPs-Endostar组肺表面及肺内转移灶均明显减少。此研究结果表明，纳米金-恩度复合溶液可显著抑制小鼠黑色素瘤肺转移。

表1 各组小鼠肺转移性结节数量和肺转移抑制率

Table 1.The number of lung metastatic nodules and the inhibition rate of lung metastasis in each group (Mean±SD.n=6)

GroupNumberofnodulesInhibitoryrate(%)Model193．8±25．30AuNPs94．0±17．4∗∗51．5Endostar79．5±17．7∗∗59．0AuNPs⁃Endostar32．3±15．3∗∗##△83．3

**P<0.01vsmodel group;##P<0.01vsAuNPs group;△P<0.05vsEndostar group.

Figure 1.The lung metastasis in each group. Black dots indicated metastatic nodules.

图1 各组小鼠肺组织的肿瘤转移情况

Figure 2.Hematoxylin and eosin staining of lung sections (×40). Arrows showed metastatic tumors.

图2 HE染色观察肿瘤的肺内转移

2 免疫荧光染色检测原位肿瘤中CD31和CA-IX的表达

与模型组相比，各处理组小鼠原位肿瘤CD31和CA-IX表达均明显减少，AuNPs-Endostar组减少最明显，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，与AuNPs组和Endostar组比较差异也有统计学意义(P<0.05)。模型组血管密度高，但血管杂乱，为异常的肿瘤血管，肿瘤组织缺氧严重，实验组肿瘤血管减少，但缺氧明显改善，见图3。此研究结果表明，纳米金结合恩度使肿瘤血管正常化，异常血管减少，缺氧改善。

1 小鼠黑色素瘤肺转移情况

如图4所示，与模型组相比，各处理组小鼠原位肿瘤坏死均明显减少，AuNPs-Endostar组肿瘤坏死最少。此研究结果表明，纳米金结合恩度使肿瘤血管正常化后，缺氧改善，肿瘤坏死减少。

Figure 3.Immunostaining of tumor sections for CD31 and CA-IX (A, ×40) and quantitative analysis (B) measured by ImageJ software. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsAuNPs-Endostar group.

图3 免疫荧光检测原位肿瘤中CD31和CA-IX的表达

Figure 4.Necrotic areas in B16-F10 tumors (hematoxylin and eosin staining, ×40). Arrows indicated necrotic areas.

图4 HE染色观察原位肿瘤的坏死情况

4 免疫组化染色检测原位肿瘤中vimentin和ZO-1的表达情况

著名的“图灵测试”（Turing Test）主张，如果人类测试者在与计算机进行交流时无法分辨其交流对象是人还是计算机，则认为计算机拥有了智能。［10］马克·瑞德尔在图灵测试的基础上提出了“拉芙莱斯测试”（Lovelace Test），如果人类测试者无法将计算机创作的文学艺术作品与自然人创作的文学艺术作品分辨开来，则可以认为计算机具有了人的创作能力。［11］这类主张根据外在特征对人工智能的创作能力进行判断的测试虽然未必能够判断出计算机是否真正拥有人的创造力，但基本上可以测试出人工智能创作是否可以达到版权法意义上相对较低的外在的独创性标准。［11］

与模型组相比，各处理组小鼠原位肿瘤的vi-mentin表达明显减少，ZO-1表达明显增加。AuNPs-Endostar组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，与AuNPs组和Endostar组比较差异也有统计学意义(P<0.05)，见图5。此研究结果表明，纳米金结合恩度可显著减少黑色素瘤的细胞骨架蛋白vimentin的表达，增加细胞间的紧密连接蛋白ZO-1的表达。

Figure 5.Immunostaining for vimentin and ZO-1 expression in the B16-F10 tumors (A, ×100) and the quantitative analysis (B) was showed. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsAuNPs-Endostar group.

图5 免疫组化检测原位肿瘤中vimentin和ZO-1的表达

讨 论

肿瘤血管生成诱发的肿瘤微环境变化在肿瘤进展过程中起到至关重要的作用[17]。与正常血管相比，肿瘤血管结构紊乱，表现为形态扭曲、管壁扩张、动静脉异常吻合、缺乏完整的周细胞覆盖、基膜不完整及通透性增高，导致肿瘤缺氧、酸中毒和高组织间液压(interstitial fluid pressure, IFP)的微环境[5, 17-18]。这种恶性微环境可转变肿瘤细胞的固有特性，使其易于通过血管裂隙转移，促进肿瘤细胞和基质细胞分泌促血管生成因子，加重血管异常，并通过影响肿瘤细胞的增殖、调节转移相关基因的表达水平、促进细胞外基质的降解来促进转移的发生[19-21]。纳米金和恩度均具有抗血管生成作用，本课题组前期研究表明，小剂量的纳米金或恩度可使肿瘤血管暂时正常化，时间窗约为用药的第4～12天；且纳米金作为药物载体具有肿瘤靶向性，结合恩度并靶向输送至肿瘤组织，二者共同发挥促肿瘤血管正常化作用，改善肿瘤的恶性微环境[15-16]。本实验旨在探究纳米金结合恩度使肿瘤血管正常化对肿瘤转移的影响。

上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在肿瘤转移过程中起重要作用，主要特征为细胞黏附分子表达的减少、细胞角蛋白细胞骨架转化为vimentin为主的细胞骨架及形态上具有间充质细胞的特征等[22]。通过EMT，上皮细胞失去极性，失去与基底膜的连接(如紧密连接蛋白ZO-1)，获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力[23]。Vimentin不仅是EMT的标志，且与黑色素瘤的转移密切相关，高表达的vimentin是黑色素瘤血道转移的预测因素之一[24]，故本研究选用vimentin和ZO-1作为检测黑色素瘤侵袭转移性的指标，实验结果证明纳米金结合恩度使原位肿瘤中CA-IX的表达明显减少，改善了黑色素瘤缺氧的内环境，使vimentin表达明显减少，抑制EMT的发生，肿瘤细胞侵袭、转移能力明显下降，ZO-1表达明显增加，肿瘤细胞间连接变得紧密，肿瘤细胞不易通过血管裂隙转移，从而减少肿瘤的血行转移。

本实验成功构建了B16-F10小鼠黑色素瘤自发性肺转移模型，经分组药物处理后，实验结果表明经AuNPs-Endostar复合体处理后，与对照组和单药组相比,黑色素瘤肺转移显著减少，肿瘤血管密度(CD31)减少，缺氧指标CA-IX表达减少，肿瘤坏死明显减少，肿瘤EMT指标vimentin表达显著减少，细胞间紧密连接ZO-1表达显著升高。这证明了纳米金结合恩度使黑色素瘤异常血管减少、血管正常化后，可以改善缺氧的肿瘤微环境，抑制上皮间质转化，使细胞间紧密连接增加，从而降低黑色素瘤的侵袭和转移能力，抑制其血行转移，且与单用恩度或纳米金相比，纳米金结合恩度可明显提高抑制转移的效果。

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(责任编辑： 卢 萍， 罗 森)

Inhibitory effect of AuNPs-Endostar on melanoma lung metastasis in mice

LI Xin, PAN Yun-long, QIN Li, LI Wei, WU Xiu, YANG Wen-de, PAN Fan

(DepartmentofGastrointestinalSurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:tpanyl@jnu.edu.cn)

AIM: To observe the influence of gold nanoparticles combined with Endostar (AuNPs-Endostar) on the melanoma lung metastasis of mice and the underlying mechanism. METHODS: C57BL/6 mice (n=24) were selected for constructing the model of spontaneous lung metastasis of melanoma B16-F10 cells. Subsequently, the mice were randomly divided into Endostar group, AuNPs group, AuNPs-Endostar group and model group. After the formation of melanoma, the mice in each group were injected with different drugs through tail vein for 0.1 mL daily. After 9 d, the mice were narcotized for cutting the tumorsinsitu. After the operation, they were raised for 2 weeks before killed for obtaining the lung tissues to observe the situation of the metastasis. HE staining was utilized for observing the necrosis status of the tumorsinsitu, while immunostaining was applied for testing the expression of CD31, carbonic anhydrase-IX (CA-IX), vimentin and zonula occludens-1 (ZO-1) in the tumors. RESULTS: Compared with model group, the pulmonary metastasis in the groups with medical treatment was obviously reduced. In AuNPs-Endostar group, the metastasis inhibition rate was the highest, and the tumor necrosis was also decreased obviously, with the significant reduction of CD31, CA-IX and vimentin expression in the tumors and significant increase in ZO-1 expression. CONCLUSION: Compared with using Endostar or AuNPs alone, the combination of AuNPs with Endostar significantly improves the curative effect of inhibiting the pulmonary metastasis of melanoma in the mice. The mechanism may be related to reducing the tumor angiogenesis, norma-lizing the blood vessels and improving tumor hypoxia, thus inhibiting the tumor epithelial-mesenchymal transition， increasing the tight junctions between tumor cells and decreasing the invasiveness.

Gold nanoparticles; Endostar; Melanoma; Neoplasm metastasis; Epithelial-mesenchymal transition

1000- 4718(2017)08- 1393- 06

2016- 11- 10

2017- 05- 08

国家自然科学基金资助项目(No. 81472849)； 广东省自然科学基金资助项目(No. 2014A030313383； No. 2014A030313382)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.008

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 020-38688859； E-mail: tpanyl@jnu.edu.cn