多重RT-PCR快速检测东南沿海城市生食水产品中致病菌污染状况

谢庆超 李 想 赵 勇 黄新新 潘迎捷 郭德华* 刘海泉，5**

（1.上海海洋大学食品学院 上海 201306；2.上海出入境检验检疫局；3.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心；4.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（上海）；5.上海海洋大学食品热加工工程技术研究中心）

多重RT-PCR快速检测东南沿海城市生食水产品中致病菌污染状况

谢庆超1，3，4李 想2赵 勇1，3，4黄新新2潘迎捷1，3，4郭德华2*刘海泉1，3，4，5**

（1.上海海洋大学食品学院 上海 201306；2.上海出入境检验检疫局；3.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心；4.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（上海）；5.上海海洋大学食品热加工工程技术研究中心）

为实现生食水产品中致病菌的快速、定量检测，构建了副溶血性弧菌及单增李斯特菌的多重RT-PCR体系。对东南沿海地区的92份生食水产品样品进行检测，并同国标方法进行比对，同时对检测结果的变化趋势进行分析。快速检测结果在36 h后得到，国标方法的结果在3-5 d后得到；经过比对，二者检出率相同，致病菌总体检出率为41.30%：其中副溶血性弧菌检出率为39.13%，单增李斯特菌检出率为20.65%。比对结果表明多重RT-PCR方法具有快速、灵敏、特异性强的优点；对检出率的分析表明东南沿海地区生食水产品中致病菌污染情况较为严重，相关部门应加强管理及控制。

多重RT-PCR；快速检测；生食水产品；致病菌

1 前言

生食水产品因其味道鲜美受到很多人的喜爱，然而生食水产品的安全状况尤其是食源性致病菌污染不容忽视[1-4]。副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是重要的食源性致病菌[5]，但国标方法的检测需要3-5 d，操作很复杂且不具有高通量性，而传统PCR方法则由于死菌DNA的污染易造成假阳性或提取方法受限造成假阴性[6]。本项目采用多重RT-PCR方法，通过DNA提取试剂盒提取DNA，并设计多重引物与探针，避免了假阳性和假阴性的产生，是一种快速、灵敏、特异性强的定量检测方法。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 试验样本

对上海市铜川路水产市场、上海市百川路水产市场、上海市东方国际水产市场、浙江省宁波市路林水产市场、福建省厦门市中埔水产市场所售三文鱼、金枪鱼、银鳕鱼、牡蛎、北极贝、扇贝进行取样，共计采样92份，每份250 g；检测指标为副溶血性弧菌和单增李斯特菌。

2.1.2 试剂

Taq DNA聚合酶、dNTP：大连TaKaRa公司；DNA提取试剂盒：北京TIANGEN生化科技有限公司；各种培养基：北京陆桥技术责任有限公司。

2.1.3 仪器设备

离心机、PCR仪、微量移液器：德国Eppendorf；电泳仪、凝胶成像分析系统：美国Bio-Rad公司；隔水式恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；BagMixer均质器：法国Interscience；7500 Fast RT-PCR仪：美国Applied Biosystems。

2.1.4 引物及探针

所有引物及探针由上海Invitrogen公司合成。

2.2 方法

2.2.1 多重RT-PCR方法

2.2.1.1 细菌培养

（1）纯培养细菌

副溶血性弧菌培养条件：取-80℃保存下甘油管中菌种液划线接种于TCBS平板，挑取单菌落于10 mL 3%氯化钠胰蛋白胨大豆肉汤 （TSB，pH 8.0）试管中，在37℃转速为180 rpm的摇床中培养10 h。

（2）单增李斯特菌培养

取-80℃保存下甘油管中菌种液划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂 （TSA）平板，挑取单菌落于10mL TSB试管中，在37℃转速180rpm的摇床中培养18h。

（3）样品培养

副溶血性弧菌：取样品25 g放入无菌均质袋，加入225 mL 3%氯化钠TSB，均质后37℃培养18 h；

单增李斯特菌：取样品25 g放入无菌均质袋，加入225 mL TSB，均质后37℃培养24 h。

2.2.1.2 细菌DNA提取

支架搭设方案为系梁支架采用满堂插扣式支架，支架布置根据系梁截面位置受力情况的不同分区域进行设计。我桥采用钢管支架满布式搭设，左右幅系梁分别搭设，宽度与系梁每侧加宽1m，纵向间距0.4m，横向间距0.6m。中横梁处搭设宽度每侧加宽1m，纵向间距0.8m，横向间距0.9m。为保证稳定性，立杆沿竖向每1.35m布设横向拉杆。

根据TIANamp DNA提取试剂盒的说明书提取DNA。其中有两处优化：溶菌酶处理时间延长为1 h，蛋白酶K处理时间延长为2 h[7]。

2.2.1.3 引物及探针设计

引物及探针设计详见表1。

表1 TaqMan引物及探针序列

2.2.1.4 多重RT-PCR体系及反应条件[7]

20μL 的多重 RT-PCR 反应体系为：2.0 μL 10×PCR 缓冲液，1.2 μL MgSO4溶液 （50 mmol/L），0.5 μL dNTPs（10 mmol/L），0.2 μL Taq 酶（5 U/μL），二对引物（10 μmol/L）各 0.5 μL，二对探针（10 μmol/L）各 0.2 μL，1.0 μL 模板 DNA，加 ddH2O 至 20 μL。

RT-PCR 反应条件为：95℃预变性 2 min，95℃变性15 s，60℃退火1 min，共进行40次循环。反应结果利用仪器自带软件7500 Software v2.0.6进行分析。

2.2.1.5 多重RT-PCR标准曲线的构建及扩增效率计算

直接平板技术法作为以上标准曲线的对照（X轴）：将携带不同菌量的纯培养物分别涂布于TCBS琼脂以及PALCAM琼脂，37℃下两种选择性培养基的培养时间分别为18 h和24 h。利用菌落计数的结果和多重实时荧光PCR输出的CT值构建反应的标准曲线，并计算曲线的斜率 （slope），利用公式E=10-1/slope-1计算多重实时荧光PCR反应的扩增效率。

2.2.2 国标检测方法

取样品25 g放入无菌均质袋，加入225 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水，均质后进行副溶血性弧菌检验[11]；取样品25 g放入无菌均质袋，加入225 mL LB1增菌液，均质后进行单增李斯特菌检验[12]。

2.2.3 统计分析

使用Microsoft Excel 2010进行作图，并利用χ2检验等方法分析事件差异。

3 结果

3.1 多重RT-PCR的标准曲线及扩增效率

两种致病菌的多重RT-PCR方法标准曲线见图1。副溶血性弧菌的标准曲线为：RT-PCR（Log CFU/g）=41.536-3.175×Viable counts （Log CFU/mL），R2=0.995；单增李斯特菌的标准曲线为：RTPCR（Log CFU/g）=43.205-3.073×Viable counts（Log CFU/mL），R2=0.998。该方法对于副溶血性弧菌和单增李斯特菌的扩增效率分别为107%和112%，结果表明该方法具有很好的稳定性可以用于检测样品中的副溶血性弧菌和单增李斯特菌。

图1 两种致病菌多重RT-PCR方法标准曲线

3.2 各种生食水产品致病菌检出率

各种生食水产品致病菌检出率见表2。快速检测结果在36 h后得到，而国标方法的结果则在3-5 d后得到，经过比对二者检出率相同。致病菌总体检出率为41.30%，其中副溶血性弧菌检出率为39.13%，单增李斯特菌检出率为20.65%。由于有的样品两种致病菌均检出，有的则只检出一种，因此单个检出率相加会与总体检出率不同。副溶血性弧菌检出率最高的是牡蛎，其次是扇贝，检出率最低的是金枪鱼。单增李斯特菌检出率最高的是牡蛎，其次是扇贝，检出率最低的是金枪鱼。

表2 各种生食水产品致病菌检出率

3.3 不同调查时间检出率比较

选取食用生食水产品较多的5-8月份，调查致病菌随季节变化的检出情况，结果见图2。5月份取样量较少，仅为5个，6月18个，7月27个，8月42个。图2显示，致病菌检出率呈现出逐步升高的趋势。

图2 不同调查时间致病菌检出率变化趋势

3.4 不同包装情况检出率比较

生食水产品基本都是两种包装及销售的形式，即散装冰鲜和真空包装冷冻销售，通过调查两种不同形式产品的检出率可以指引消费者选择更安全的产品。两种包装形式致病菌检出情况见图3。图3显示，真空包装冷冻产品检出率明显低于散装冰鲜产品，但两者随月份的增加都是上升的趋势。

图3 不同包装情况致病菌检出率时间变化趋势

4 讨论

张辉等[13]针对hlyA基因建立的PCR方法，具有较强的特异性。该方法对纯培养物的最低检测限为7.3 CFU/mL，对模拟污染的生猪肉和蔬菜的检测低限为4 CFU/g，牛奶为4 CFU/mL。应用该方法对285份食品样品检测，17份样品呈阳性，与常规的分离培养方法完全一致。Omiccioli等[9]通过双标记的探针和对熔解曲线的分析建立了能同时检测牛奶中广泛存在的沙门氏杆菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157病原体的多元实时定量PCR，通过可以同时使病原菌增殖的增菌步骤，在2 d内完成对5组25 mL生牛奶中每一种病原菌1 CFU的检测。

2010-2011年上海浦东新区食品药品监督所对上海市各类生食水产品病原菌污染情况进行了检测，共检测样品204份，检出致病菌27份，检出率13.24%[14]。本项目调查中致病菌检出率高达41.30%，从检出的致病菌种类来看，副溶血性弧菌检出率高于单增李斯特菌，这说明副溶血性弧菌是生食水产品中最常见的致病微生物。主要原因是生食水产品大多都是海产品，而海水的盐度非常适合副溶血性弧菌的生长。通过对比散装冰鲜产品及真空包装冷冻产品的感染情况可以看出，散装冰鲜产品感染率远高于后者。一方面可能是鱼体自身感染的细菌，但更大的可能是销售中的交叉污染造成，因为天气炎热，鱼肉中细微的变质肉眼看不出来，但一旦堆放在一起销售，就很容易造成交叉污染。而真空包装冷冻产品也有检出，一方面可能是鱼体自身感染的细菌，也有可能是加工企业管理不严格造成的交叉污染或者加工工具的污染。

从时间变化上来看，随着由春入夏气温升高，致病菌的检出率上升，这与纯培养状态下细菌的生长曲线相吻合。

通过本次调查可以看出，生食水产品中病原微生物感染情况很严重，食用不当可能会引发群体腹泻等食品安全事件。在爆发突发性食品安全事故时，快速溯源非常重要，有利于控制发病源进而控制疫情的蔓延。在调研中，很多经营者所说的产品原产地经证实有部分不属实，以次充好、以假乱真现象时有发生。如果消费者或是政府监管部门能随时查到商品来源及产品信息，对突发风险的控制以及消费者权益的保障都有利。同时消费者自身很关注食品安全，但是由于生食性水产品烹饪不当引发的食品安全事件也很多，主要是因为消费者接收信息范围窄，有时尚未意识到自己饮食的方式不安全，这就需要政府积极引导。根据本项目的调查结果，食用散装冰鲜产品感染疾病风险较大，可以引导消费者食用真空包装冷冻保藏的产品。

5 结论

本研究建立了快速、定量检测水产品中副溶血性弧菌及单增李斯特菌的多重RT-PCR方法，通过对东南沿海地区的92份生食水产品样品的检测表明，致病菌总体检出率为41.30%，其中副溶血性弧菌检出率为39.13%，单增李斯特菌检出率为20.65%。该方法内在36 h内实现对水产品中致病菌的定量检测，远快于国标方法，具有快速、灵敏、特异性强的优点；同时检测结果分析表明东南沿海地区生食水产品中致病菌污染情况较为严重，相关部门应加强管理及控制。

[1]高培.生食水产品食用安全性研究[J].食品研究与开发，2005，（5）：202-205.

[2]秦品章.生食水产品的卫生 （综述）[J].中国食品卫生杂志，2000，（5）：40-43.

[3]郑理.上海市炝、醉小水产品卫生状况的调查研究[J].中国食品卫生杂志，1996，8（1）：41-43.

[4]郑鹏然，周树南.食品卫生全书[M].北京：红旗出版社，1996：1415-1426.

[5]戴昌芳，方悦怡，严纪文，等.生食水产品常见病原微生物污染与安全性评价[J]. 中国公共卫生，2006，（4）：449-450.

[6]刘海泉，赵强，孙晓红，等.多重PCR快速检测食品中的单核细胞增生性李斯特菌[J]. 中国农业科学，2010，43（23）：4893-4900.

[7]Zhaohuan Zhang，Haiquan Liu，Yang Lou，etal.Quantifying viableVibrioparahaemolyticusandListeriamonocytogenessimultaneously in raw shrimp[J].Appl Microbiol Biotechnol，2015，99：6451-6462.

[8]Nordstrom J L，Vickery M C L，Blackstone G M，etal.Developmentofamultiplexreal-timePCR assaywith an internal amplification controlfor the detection of totaland pathogenicVibrio parahaemolyticusbacteria in oysters[J].Appl Environ Microbiol，2007，73：5840-5847.

[9]Omiccioli E，Amagliani G，Brandi G，et al.A new platform for Real-Time PCR detection ofSalmonellaspp.，Listeria monocytogenesand Escherichia coli O157 in milk[J].Food Microbiol，2009，26：615-622.

[10]Zhang Z H，Xiao L L，Lou Y，et al.Development of a multiplex real-time PCR method for simultaneous detection ofVibrio parahaemolyticus，Listeria monocytogenesandSalmonellaspp.in raw shrimp[J].Food Control，2015，51：31-36.

[11]GB 4789.7-2013食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验[S].

[12]GB 4789.30-2010食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验[S].

[13]张辉，王兴龙.食品中单核细胞增生性李斯特氏菌PCR快速检测[J]. 食品科学，2008，29（4）：324-327.

[14]汤志荣，张磊，腾迪云.上海市生食水产品安全监管研究[J].上海食品药品监管情报研究，2012，12（119）：18-21.

Rapid Detection of Pathogen Pollution in Raw Seafood in the Southeast Coastal City by Multiple RT-PCR

XIE Qingchao1，3，4， LI Xiang2， ZHAO Yong1，3，4， HUANG Xinxin2， PAN Yingjie1，3，4，GUO Dehua2*， LIU Haiquan1，3，4，5**
（1.College of Food Science and Technology， Shanghai Ocean University， Shanghai， 201306；2.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau；3.Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing&Preservation；4.Laboratory of Quality&Safety Risk Assessment for Aquatic Product on Storage and Preservation（Shanghai）， Ministry of Agriculture 5.Engineering Research Center of Food Thermal-processing Technology， Shanghai Ocean University）

A multiple real time polymerase chain reaction （RT-PCR） system was developed to detectVibrio parahemolyticusandListeria monocytogenesin raw seafood quickly and quantitatively.92 samples of raw seafood which were sampled in the southeast coastal city of China were tested and compared with standard methods，then analysis detectable rate variation tendency in time.The rapid test results were obtained 36 h later and standard methods test results were obtained 3-5 d later，both of the two methods had same detectable rate.The total detectable rate of pathogens was 41.30%，and the detectable rate ofVibrio parahemolyticusandListeria monocytogeneswere 39.13% and 20.65%.The comparison results showed that multiple RT-PCR method is rapid，sensitive and specific.The investigation results showed that pathogens pollution in raw seafood in the southeast coastal city was relatively serious，and the relevant departments should strengthen the management.

Multiple RT-PCR；Rapid Detection；Raw Seafood；Pathogen

TS207.4；Q789

E-mail：qcxie@shou.edu.cn；*通讯作者E-mail：guodeh@shciq.gov.cn；**通讯作者E-mail：hqliu@shou.edu.cn

国家自然科学基金面上项目 （31571917，31671779）；上海市科技兴农重点攻关项目 （2015第4-8号、2016第1-1号）；上海市教委曙光计划 （15SG48）

2017-04-06