HPLC法测定心肾安颗粒中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量

范金钊，丁晓芳，白 林，李 欣（.解放军总医院制剂中心，北京 00853；.安徽蚌埠医学院，安徽 蚌埠 33000）

HPLC法测定心肾安颗粒中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量

范金钊1，丁晓芳2，白 林1，李 欣1（1.解放军总医院制剂中心，北京 100853；2.安徽蚌埠医学院，安徽 蚌埠 233000）

目的：建立心肾安颗粒中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量的测定方法。方法：色谱柱：Diamonsil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 µm）；流动相：乙腈-水（16 : 84）；检测波长：320 nm；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 µL；柱温：35 ℃。结果：2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在3.767 4 ～ 25.116 0 µg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系（r= 1）；2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的平均回收率为99.80%；RSD为1.47%（n= 9）。结论：本方法操作简单，专属性强，灵敏度高，可用于心肾安颗粒中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量测定。

HPLC；心肾安颗粒；2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷；含量测定

心肾安颗粒是解放军总医院非标准制剂，由党参、黄芪、当归、何首乌等20味中药组成，具有强心益肾，活血化瘀，舒筋活络，舒肝养血等功效。该药用于心肾阳虚，精血不足所致的疲倦乏力，心悸怔忡，腰膝酸软，畏寒，肢冷，小便余沥，不孕不育及更年期综合症，前列腺增生等症。何首乌具有补肝肾，益精血，乌须发，强筋骨之效[1]，何首乌的主要活性成分是2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷。本研究采用HPLC法对心肾安颗粒中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷进行含量测定，旨为该制剂的质量控制提供理论参考。

1 仪器与试药

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；MS205DU电子天平（德国METTLER TOLEDO公司）；UV-2550紫外分光光度计（日本岛津公司）；BQ-12超声清洗机（北京精益荣华首饰器材有限公司）。

2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品（中国食品药品检定研究院，纯度：91.0%，批号110844-201310）；心肾安颗粒（本院自制，规格：5 g，批号：140601，140602，140302）；乙腈为色谱纯。

2 方法

2.1 色谱条件

Diamonsil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 µm）；流动相：乙腈-水（16 : 84）；检测波长：320 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃[2]；进样量：10 µL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液取2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，精密称定，置50 mL棕色容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。再精密量取储备液0.5 mL至10 mL棕色容量瓶中，加稀乙醇定容到刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液取心肾安颗粒研成细粉，取约1.0 g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，加稀乙醇30 mL，称定重量，超声处理30 min，冷却至室温，加稀乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液按该制剂处方取除何首乌以外的其余成分，制备成阴性样品，并按上述供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。

2.3 系统适用性实验

精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液，按“2.1”项下色谱条件，进样分析，2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷色谱峰和其他成份色谱峰分离度大于1.5，且阴性样品无干扰。见图1。

图1 HPLC色谱图A – 对照品，B – 供试品，C – 阴性样品；1 – 2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷Fig 1 HPLC chromatogramsA – reference substance, B – sample, C – negative reference substance; 1 – 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside

2.4 线性关系考察

取2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加稀乙醇使溶解，制得浓度为3.767 4、6.279 0、12.558 0、18.837 0、25.116 0 µg·mL-1的系列对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，进样记录，以2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的峰面积（Y）为纵坐标，浓度（X）为横坐标绘制标准曲线，得线性回归方程为：Y= 47.572X– 0.363 3（r= 1），结果表明，2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在3.767 4 ～ 25.116 0 µg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度实验

精密吸取对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，计算2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的峰面积RSD为0.34%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性实验

取同一批次心肾安颗粒（批号1460602）约1 g，共6份，精密称定，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量RSD为1.43%。表明方法重复性良好。

2.7 稳定性考察

取心肾安颗粒约1 g，精密称定，制备成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，在室温条件下，分别于0、2、4、6、8 h进样测定，记录峰面积，计算2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的峰面积RSD为1.43%，表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.8 回收率实验

取已知含量的心肾安颗粒（批号1460601）9份，每份约1.3 g，精密称定，分别精密加入一定量的对照品储备液，按“2.2”项下方法制备成供试品溶液，进样测定，记录峰面积并计算回收率。结果见表1。

表1 心肾安颗粒加样回收率实验结果.n= 9Tab 1 Results of recovery test forXinshenangranules.n= 9

2.9 含量测定

取心肾安颗粒3批，每批心肾安颗粒3份，按“2.2.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，每份供试品溶液进样2次，详见表2。

表2 心肾安颗粒含量测定结果.n= 3Tab 2 Contents determination ofXinshenangranules.n= 3

3 讨论

3.1 提取方法和时间的考察

分别考察在乙醇、稀乙醇、甲醇[3-5]中的提取率，结果表明在稀乙醇中提取率相对较高；对2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷进行超声、回流提取[6-7]，并对超声、回流法提取时间进行考察，试验结果表明加热回流与超声处理30 min提取率高且相近，考虑到操作的便捷性，最终采用稀乙醇超声处理30 min[3-5]。

3.2 流动相的考察

曾参考《中国药典》2015年（一部）何首乌药材的含量测定方法[1]，以乙腈-水（25 : 75）为流动相进行含量测定，结果显示2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷色谱峰与其他杂质峰分离度较低，因此筛选流动相比例，选用乙腈-水（16 : 84）作为流动相，2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷色谱峰与其他杂质峰分离度大于1.5，峰形对称，灵敏度高。

经方法学考查，本文建立的检测方法操作简便，分离度好，重现性佳，回收率高，能更好的控制心肾安颗粒的质量。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：175-176.

[2] 白林，范金钊，徐风华，等.HPLC法测定复方樟脑软膏中樟脑的含量[J].中国药物应用与监测，2014，11（4）：212-213.

[3] 董志同，李妍.RP-HPLC法测定参竹精颗粒中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量[J].中国民族医药杂志，2015，（7）：64-65.

[4] 赵宏峰，徐芳菲，郭禹彤.RP-HPLC测定益血合剂（无糖型）中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量[J].中国医药指南，2015，13（31）：31-33.

[5] 贺康洪，潘志浩，张汉道.HPLC法同时测定归芪消白胶囊中二苯乙烯苷和丹皮酚的含量[J].解放军药学学报，2015，31（3）：235-237.

[6] 太成梅，张清波.HPLC法测定蒲参胶囊中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量[J].中国药品标准，2014，15（5）：357-359.

[7] 王红，杨慈海，宋军.高效液相色谱法测定补脑安神片中二苯乙烯苷含量[J].中国药业，2016，25（16）：72-74.

Determination of 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside inXinshenangranules by HPLC

FAN Jin-zhao1, DING Xiao-fang2, BAI Lin1, LI Xin1(1. Department of Preparation Center, PLA General Hospital, Beijing 100853, China; 2. Bengbu Medical College, Bengbu 233000, China)

Objective:To establish a method for determination of 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside inXinshenangranules.Methods:Diamonsil C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 µm) was used with a mobile phase consisting of acetonitrile-water (16 : 84). The detection wavelength was 320 nm with a fl ow rate of 1.0 mL·min-1. Column temperature was 35 ℃.Results:The 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside had a good linear relationship within the range of 3.767 4 – 25.116 0 μg·mL-1(r= 1). The average recovery was 99.80%, RSD was 1.47% (n= 9).Conclusion:This method is simple, accurate and high sensitive, which can be used for content determination of 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside inXinshenangranules.

HPLC;Xinshenangranules; 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D- glucoside; Content determination

R917

A

1672 – 8157(2017)04 – 0209 – 03

2016-12-20

2017-03-10）

李欣，女，副主任药师，研究方向：新药研发，药品质量控制。E-mail：doublelixin@126.com

范金钊，男，药师，研究方向：药物分析与药品质量控制。E-mail：fanjinzhaozy@163.com