2型糖尿病合并不同程度蛋白尿患者的血清对足细胞自噬的影响

雍慧娟,朱仙艺,叶小龙,冯亚敏,鲁一兵,丁大法

(南京医科大学第二附属医院内分泌科，江苏 南京 210011)

2型糖尿病合并不同程度蛋白尿患者的血清对足细胞自噬的影响

雍慧娟,朱仙艺,叶小龙,冯亚敏,鲁一兵,丁大法

(南京医科大学第二附属医院内分泌科，江苏 南京 210011)

目的：探讨2型糖尿病(T2DM)合并不同程度蛋白尿患者的血清对足细胞自噬的影响。方法：选取40例T2DM患者，根据尿白蛋白与尿肌酐比值(UACR)分为正常白蛋白尿组(15例)、微量白蛋白尿组(14 例)和大量白蛋白尿组(11例)，同时选取14例正常体检者为对照组，比较4组空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、收缩压、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、ACR等临床指标。分别用各组受试者的血清处理小鼠足细胞48 h后，观察电镜下足细胞自噬形态、自噬蛋白LC3及凋亡蛋白Cleaved-caspase 3水平的变化。结果:与对照组比较，T2DM各组ACR、FBG、HbA1c、LDL-C、收缩压明显升高，HDL-C明显降低(P<0.01)；T2DM各组ACR比较差异有统计学意义(P<0.01)。与对照组比较，T2DM各组自噬数目下降，LC3-Ⅱ表达量降低，Cleaved-caspase 3表达量增加；与正常白蛋白尿组比较，微量白蛋白尿组和大量白蛋白尿组LC3-Ⅱ表达量下降(P<0.05)，Cleaved-caspase 3表达量增加(P<0.01)；LC3-Ⅱ表达量水平与T2DM患者蛋白尿增加呈负相关(P<0.05)。结论：T2DM合并不同程度蛋白尿患者的血清能降低足细胞自噬，提示患者血清中含有相关因子调控自噬，进而损伤足细胞，促进蛋白尿产生。

2型糖尿病；足细胞；白蛋白尿；自噬；血清

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，其早期即伴随着足细胞损伤及蛋白尿的形成。近年来，足细胞病变被认为是DN发病机制的中心环节，也是蛋白尿产生的重要原因[1-2]。DN中足细胞自噬水平的抑制在足细胞病变中起重要作用，但具体机制尚不完全不清楚。临床研究[3]表明，糖尿病患者血清中含有的细胞因子如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)等各种炎症因子能够诱导足细胞损伤，加重蛋白尿产生，具体机制尚不明确。本研究拟通过在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)合并不同程度蛋白尿患者的血清中培育足细胞，旨在探讨此类患者血清对足细胞自噬的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2015年9月至2016年9月在南京医科大学第二附属医院门诊就诊及住院的T2DM患者40例，均符合1999年世界卫生组织(World Health Organization，WHO)中关于T2DM的诊断标准，排除心、肝等重要器官病变；其他各种感染性疾病；未使用血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitors，ACEI)或血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(angiotensin receptor blocker，ARB)类药物。根据尿蛋白排泄率(尿微量白蛋白/尿肌酐比值，albumin-to-creatinine ratio，ACR)，将患者分成3组：正常白蛋白尿组15例(ACR<30 mg/g)，微量白蛋白尿组14例(ACR30～300 mg/g)和大量白蛋白尿组11例(ACR>300 mg/g)。正常白蛋白尿组：年龄(60.0±7.0)岁；病程(20.0±7.0)年；体质量指数(body mass index，BMI)(26.4±3.4)kg/m2。微量白蛋白尿组：年龄(58.0±9.0)岁；病程(19.0±8.0)年；BMI(27.2±2.5)kg/m2。大量白蛋白尿组：年龄(61.0±6.0)岁；病程(22.0±5.0)年；BMI(26.5±3.5)kg/m2。随机选择在南京医科大学第二附属医院体检健康者14例为对照组，年龄(58.0±6.0)岁；BMI(25.5±2.3)kg/m2。本研究获得南京医科大学伦理委员会批准(伦审2016-59-2号)，受试者均签署知情同意书。各组年龄、BMI比较无显著差异(P>0.05)，可比性良好。

1.2 方法

1.2.1 血标本采集和血清分离 所有受试者均禁食12 h后于次日晨起空腹采集肘正中静脉血4 mL，放入不加抗凝剂的无菌离心管内，室温静置30 min后，3 000 r/min离心15 min(离心半径13.5 cm)，分离血清，存于EP管中，-80 ℃低温冰箱保存、备用。常规测定空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterin，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterin，HDL-C)；留取晨尿测定尿白蛋白及尿肌酐。

所有受试者留取静脉血5 mL，注入无菌玻璃试管，4 ℃放置lh待其凝固后，1 500 r/min离心10 min，分离血清，分装后保存于-70 ℃低温冰箱中保存、备用。

1.2.3 足细胞培养 小鼠MPC5培养方法参照文献[2]。足细胞快速复苏后用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)及γ干扰素的RPMll640培养液于33 ℃传代增殖，继而接种到25 cm2培养瓶(3.0×105个/瓶)或六孔板内(1.0×105个/L)，于37 ℃诱导分化后进行实验。

1.2.4 透射电镜观察 将足细胞传代种植于六孔板上，细胞贴壁融合达60%后，分别予以4组血清培养24 h，0.25%胰酶消化细胞，冰PBS洗涤2遍，收集细胞后用2.5%戊二醛固定过夜，再予1%锇酸固定3 h，经脱水、渗透、包埋、超薄切片、醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，在透射电子显微镜(日本JEOL公司)下观察。

1.2.5 Western blot法观察足细胞蛋白表达情况 PBS洗涤细胞2次，按100∶1加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂(100+1)μL，细胞培养瓶刮下细胞并于冰上裂解30 min，然后4 ℃，12 000 r/min离心10 min取上清，按1/5体积加入6×上样缓冲液，100 ℃金属浴变性10min。应用考马斯亮蓝法测浓度，等量样品(30 μg蛋白)以SDS-PAGE分离蛋白质，电泳后将蛋白转移至硝酸纤维膜上，室温下5%脱脂奶粉封闭1.5 h，加一抗(LC3抗体，美国Santa Cruz公司和Cleaved Caspase-3抗体，美国Cell Signaling Technology公司，稀释比例1∶2 000)孵育，慢摇0.5 h后4 ℃过夜。0.5 h室温下复温后，1xTBST洗一抗，加辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)标记山羊抗兔二抗(1∶5 000稀释，美国Abbkine公司)，室温孵育1 h，1xTBST洗二抗，加发光液后用天能凝胶成像系统进行图像扫描记录。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组临床指标比较

与对照组比较，T2DM各组ACR、FBG、HbA1c、LDL-C、收缩压均明显升高，HDL-C明显降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；T2DM各组ACR比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 各组临床指标比较±s)，中位数(四分位数)]

*P<0.01，与对照组比较；#P<0.01，与正常白蛋白尿组比较；△P<0.01，与微量白蛋白尿组比较。

2.2 T2DM各组患者血清对足细胞自噬的影响

分别用各组受试者血清处理小鼠足细胞48 h后，观察电镜下足细胞自噬形态的变化。结果显示：透射电镜下可见典型的自噬体形成，表现为胞质内游离的单层或双层膜结构包裹细胞质或损伤的细胞器形成泡状结构。与对照组比较，透射电镜下可见T2DM各组患者足细胞自噬数目及体积明显减少，且自噬数目随着蛋白尿的增多呈逐渐下降趋势。见图1。

2.3 T2DM各组患者血清对足细胞自噬蛋白及足细胞凋亡蛋白的影响

分别用各组受试者血清处理小鼠足细胞48 h后，观察足细胞自噬蛋白LC3，凋亡蛋白Cleaved-caspase 3水平的变化。结果显示：与对照组比较，T2DM各组LC3-Ⅱ表达量下降，Cleaved-caspase 3表达量增加；与正常白蛋白尿组比较，微量白蛋白尿组和大量白蛋白尿组LC3-Ⅱ表达量均下降(P<0.05)，Cleaved-caspase 3表达量增加，差异显著(P<0.01)。LC3-Ⅱ表达量下降与T2DM患者蛋白尿增加呈显著负相关(P<0.05)。见图2。

3 讨论

DN是以白蛋白尿、肾小球肥大、肾小球滤过率降低、肾脏纤维化为特点并最终导致肾功能衰竭的慢性疾病。白蛋白尿为肾小球损伤的标志物，代表着器官早期损伤，多年来被公认为1型糖尿病和T2DM患者肾功能衰退的早期诊断指标，以及糖尿病患者大血管、微血管的危险因素。研究[4]表明，微量蛋白尿可增加糖尿病患者终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)的风险及全因死亡率，减少蛋白尿可延缓肾功能恶化，积极控制蛋白尿可使ESRD发生风险降低17%。然而，采用微量白蛋白尿作为早期诊断指标仍存在很多不确定性。一项长期随访研究[5]发现，只有一部分微量白蛋白尿的糖尿病患者进一步进展为临床肾病，而相当一部分患者可以维持或者逆转。更重要的是，部分患者无蛋白尿，但估算的肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)却明显下降。对534例1型糖尿病患者进行了平均8年的随访观察，发现正常白蛋白尿的患者有10%出现早期肾功能下降(进行性eGFRcr-cys下降，至少每年3.3%)[6]。因此，以尿微量白蛋白尿作为早期DN指标筛选，存在不确定性和变异性。

自噬能清除不正常构型的蛋白质，并消化受损和多余的细胞器，是真核细胞中广泛存在的降解/再循环系统，在细胞新陈代谢、结构重建、生长发育中起着重要作用[7]。自噬缺失参与的代谢性相关疾病包括糖尿病和肾病的发病过程[8]。正常情况下，足细胞具有较高的自噬活性，在DN患者和动物模型中均发现肾脏足细胞的自噬功能受损[9]。特异性敲除足细胞中Atg5的老龄小鼠，会发生肾小球疾病和蛋白尿，且随着氧化应激产物和泛素化蛋白内质网应激损伤的积累足细胞自噬受损[10]。

作为炎性细胞因子，高糖、脂肪酸、HO-1、TNF-α等是DN的主要致病因素。但血清因子中的每一个以及其组合却对自噬活性没有影响，在不同的模型和细胞中作用不一样，表明血清中其他因素可能改变足细胞中的自噬。研究[11-12]表明，部分血清因子在某种条件下可改变细胞内信号通路和自噬活性，进一步提示与糖尿病大量蛋白尿相关的一些血清因子可能抑制足细胞自噬。为了确定这种可能性，本研究采用不同程度尿白蛋白排泄率的T2DM患者的血清来刺激小鼠足细胞，以观察足细胞自噬的变化，结果显示：与对照组比较，T2DM各组患者血清能明显减少足细胞自噬的发生，且随着蛋白尿程度的加重，足细胞自噬降低越明显，提示不同程度的蛋白尿糖尿病患者血清里所含物质能够影响足细胞自噬和凋亡。关于血清中所含的重要标志物，比如高糖、脂肪酸、HO-1、TNF-α等，需要进一步研究。此外，本研究亦发现，自噬不足与DN进展为大量蛋白尿有明显的相关性，进一步补充了微量蛋白尿在诊断糖尿病肾病和糖尿病肾病的预后的不足。我们也可以探索血清相关标志物对足细胞自噬的影响，联合尿微量白蛋白诊断糖尿病肾病以及糖尿病肾病预后，补充因蛋白尿变异性，蛋白尿自发性降解等缺点带来早期2型糖尿病肾病诊断的不确定性。

综上所述，T2DM合并不同程度蛋白尿患者的血清能够降低足细胞自噬，提示T2DM合并蛋白尿患者血清中含有相关因子调控自噬，进而损伤足细胞，促进蛋白尿产生。

[1] Kumar PA,Welsh GI,Raghu G,etal.Carboxymethyl lysine induces EMT in podocytes through transcription factor ZEB2:Implications for podocyte depletion and proteinuria in diabetes mellitus[J].Arch BiochemBiophys,2016,590:10-19.

[2] Miner JH.Podocyte biology in 2015:New insights into the mechanisms of podocyte health[J].Nat Rev Nephrol,2016,12(2):63-64.

[3] Karadag S,Sakci E,Uzun S,etal.The correlation of inflammatory markers and plasma vaspin levels in patients with diabetic nephropathy[J].Ren Fail,2016,38(7):1044-1049.

[4] Heerspink HJ,Kr pelin TF,Hoekman J,etal.Drug-induced reduction in albuminuria is associated with subsequent renoprotection:a meta-analysis[J].J Am SocNephrol,2015,26(8):2055-2064.

[5] MacIsaac RJ,Ekinci EI,Jerums G.Progressive diabetic nephropathy.How useful is microalbuminuria:contra[J].Kidney Int,2014,86(1):50-57.

[6] Krolewski AS,Niewczas MA,Skupien J,etal.Early progressive renal decline precedes the onset of microalbuminuria and its progression to macroalbuminuria[J].Diabetes Care,2014,37(1):226-234.

[7] Behrends C,Sowa ME,Gygi SP,etal.Network organization of the human autophagy system[J].Nature,2010,466(7302):68-76.

[8] Wang Y,Li YB,Yin JJ,etal.Autophagy regulates inflammation following oxidative injury in diabetes[J].Autophagy,2013,9(3):272-277.

[9] Fang L,Li X,Luo Y,etal.Autophagy inhibition induces podocyte apoptosis by activating the pro-apoptotic pathway of endoplasmic reticulum stress[J].Exp Cell Res,2014,322(2):290-301.

[10]Hartleben B,Godel M,Meyer-Schwesinger C,etal.Autophagy influences glomerular disease susceptibility and maintains podocyte homeostasis in aging mice[J].J Clin Invest,2010,120(4):1084-1096.

[11]Cohen HY,Miller C,Bitterman KJ,etal.Calorie restriction promotesmammalian cell survival by inducing the SIRT1 deacetylase[J].Science,2004,305(5682):390-392.

[12]Kume S,Uzu T,Horiike K,etal.Calorie restriction enhances cell adaptationto hypoxia through Sirt1-dependent mitochondrial autophagy in mouse agedkidney[J].J Clin Invest,2010,120(4):1043-1055.

(学术编辑：左莹)

本刊网址：http：//www.nsmc.edu.cn

作者投稿系统：http：//noth.cbpt.cnki.net

邮箱：xuebao@nsmc.edu.cn

Effect of serum on podocyte autophagy in patients with type 2 diabetes mellitus complicated by different degrees of albuminuria

YONG Hui-juan,ZHU Xian-yi,YE Xiao-long,FENG Ya-min,LU Yi-bing,Ding Da-fa

(DepartmentofEndocrinology,TheSecondAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210011,Jiangsu,China)

Objective：To explore the effect of serum on the podocyte autophagy in patients with type 2 diabetes mellitus (T2DM) complicated by different degrees of albuminuria.Methods：According to urinary albumin-to-creatinine ratio (UACR),40 patients with T2DM were divided into normal albuminuria group (n=15),microalbuminuria group (n=14) and macroalbuminuria group (n=11).Meanwhile,14 healthy people were selected as control group.The clinical indexes of fasting blood glucose (FBG),glycosylated hemoglobin (HbA1c),systolic blood pressure,low density lipoprotein cholesterin (LDL-C),high density lipoprotein cholesterin (HDL-C) and ACR were all compared in four groups.After the mouse podocytes were intervened 48 h by the subject serum in each group,the changes of podocyte autophagymorphology,autophagy protein LC3 and apoptosis protein Cleaved-caspase 3 levels were observed.Results:Compared with control group,ACR,FBG,HbA1c,LDL-C and systolic blood pressure were all increased,while HDL-C was decreased significantly in each group of T2DM (P<0.01).Significant differences were shown among each group of T2DM regarding the ACR (P<0.01).Compared with control group,both the number of podocyteautophagy and level of LC3-Ⅱexpression went down,whereas the level of Cleaved-caspase 3 expression went up in each group of T2DM.Compared with normal albuminuria group,the level of LC3-Ⅱexpression increased(P<0.05),while that of Cleaved-caspase3 expression decreased in both microalbuminuria and macroalbuminuria groups (P<0.01).The level of LC3-Ⅱexpression was negatively correlated with increased albuminuria in patients with T2DM (P<0.05).Conclusion:The serum in T2DM patients with different degrees of albuminuria can reduce the podocyte autophagy,suggesting that the serum in T2DM patients with different degrees of albuminuria contains relevant factors to regulate the autophagy,which can damage the podocytes and increase albuminuria.

Type 2 diabetes mellitus;Podocytes;Albuminuria;Autophagy;Serum

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.04.008

国家自然科学青年基金(H0713)；江苏省大学生创新创业训练计划(201610312013Z)

2017-03-10

雍慧娟(1985-)，女，博士，主治医师。E-mail:yong-0503@163.com

丁大法，E-mail:dingdafa2004@aliyun.com

时间：2017-8-15 11∶26 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170815.1126.016.html

1005-3697(2017)-04-0507-04

R692

A