新型水溶性卟啉类光敏剂的体外抗菌作用

赵占娟，耿文一，樊紫瑜，洪阁，刘天军

(1.河北大学 医学院，河北 保定 071002；2.暨南大学 医学院， 广东 广州 510632；3.中国医学科学院 生物医学工程研究所,天津市生物医学材料重点实验室，天津 300192)

新型水溶性卟啉类光敏剂的体外抗菌作用

赵占娟1，耿文一2，樊紫瑜1，洪阁3，刘天军3

(1.河北大学 医学院，河北 保定 071002；2.暨南大学 医学院， 广东 广州 510632；3.中国医学科学院 生物医学工程研究所,天津市生物医学材料重点实验室，天津 300192)

为了探讨新型卟啉类光敏剂光动力体外灭菌的活性,体外培养了抗药性金黄色葡萄球菌(MRSA)、大肠杆菌(Escherichiacoli)和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) 3种菌株,分别检测3种细菌对5种卟啉化合物(PA1—PA5)的吸收量,菌落计数法检测PA1—PA5对3种细菌的光反应、暗反应浓度曲线;激光共聚焦显微镜检测细菌吞噬光敏剂的情况.结果发现，5种卟啉类化合物均具有较缓慢的光漂白率和较强的单线态氧产生能力.激光共聚焦显微镜的检测结果也表明，3类菌株可以选择性地吸收化合物PA1—PA5.相比于其他4种光敏剂,PA1表现出明显的杀菌性能，当PA1浓度增加为31.25 μmol/L时，光照PA1对3种细菌的灭活率达100%.PA1对3种细菌的光动力灭菌效果最好，未来具有良好的使用前景.

光动力抗菌化学疗法；创伤感染；光敏剂；卟啉衍生物

抗生素的不合理应用致使细菌产生了严重的多重耐药性，影响了人类的健康.因此寻求可以替代抗生素进行抗感染治疗的药物、方法就变得比较急切.光动力抗菌化学疗法(photodynamic antimicrobial chemotherapy, PACT)是一种氧化损伤反应，治疗后病菌不会产生耐药性[1-3].PACT的治疗关键是具有理想的光敏剂.卟啉化合物及其衍生物在生物体内广泛存在，具有良好的光谱特性和较高的单线态氧的产量，具有抗肿瘤的特性同时在抗病毒、抗细菌方面也展现出良好的前景[4-5].目前，医药科技方面的研究多是在卟啉的性能及结构基础上进一步设计、合成及应用研究[6]，而光敏剂的氧化损伤机制又与其化学结构紧密相连.本实验室将卟啉与氨基极性基团连接合成出了5种新型光敏化合物，对此类光敏化合物的体外抗菌活性效果进行了评价，探讨将其应用于抗菌的可行性.

1 材料及方法

1.1 光敏剂

光敏剂PA1—PA5为本实验室合成产物，深红色粉末，用二甲基亚峰(DMSO)作为溶剂配制原液浓度为10-2mol/L，体外实验再用无菌的LB液体培养基进行稀释使用.

1.2 主要仪器与试剂

半导体激光器(7404,Intense,USA，650 nm光纤输出); 多功能酶标仪(Thermo3001美国)； 无菌磷酸盐缓冲液(PBS)(Thermo美国)；十二烷基硫酸钠(SDS)(天津市江天化工技术有限公司);激光共聚焦显微镜(LSM710 德国).

1.3 实验菌株

标准质控菌株大肠埃希菌Escherichiacoli(E.coli)(ATCC 25922),抗药性金黄色葡萄球菌Methicillin resistantStaphylococcusaureus(MRSA) (临床分离菌株),铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa(ATCC 27853)均由解放军307医院惠赠.

1.4 方法实验

1.4.1 光漂白实验(bleaching)[7]

用DMSO作为溶剂，将化合物PA1—PA5配成浓度为2.0×10-5mol/L的稀溶液，取 200 μL放入96孔板内，用酶标仪检测化合物的光吸收值(300～800 nm).将上述溶液用激光(650 nm)照射5 min，能量密度为6 J/cm2.然后再用酶标仪检测各化合物的光吸收值(300～800 nm).共测定6次，总照射时间为30 min.观察光吸收值的变化情况.

1.4.2 化合物PA1—PA5的单线态氧测定方法[8]

1.4.2.1 2,5-二苯基-3,4-苯并呋喃(DPBF)溶液的制备

用1 mL DMSO溶解5.4 mg DPBF粉剂，配置成浓度为2×10-2mol/L的DPBF原液，再取2 μL DPBF原液和2 mL DMSO混匀得到2×10-5mol/L的DPBF溶液.

1.4.2.2 化合物的单线态氧测定

1)吸取100 μL DPBF(2×10-5mol/L)溶液放入96孔板内并使用激光进行照射检测光照对DPBF产生的消耗.

2)吸取100 μL药物溶液(2×10-5mol/L)放入同上的96孔板内进行激光照射检测光照对药物溶液的影响.

3)取浓度为2×10-5mol/L的光敏剂100 μL和浓度为2×10-5mol/L 的DPBF 100 μL混匀.用波长为650 nm的激光器对上述溶液进行照射，能量密度为6 J/cm2，光照后每隔10 s用酶标仪检测410 nm处的吸收光度值.检测时间为120 s.

1.4.3 吸收速度的测定方法[9]

1.4.3.1 配制标准曲线

用质量分数1%SDS作为溶剂配制化合物PA1—PA5溶液，浓度分别为 0.4、0.8、1.56、 3.13、 6.25、12.5、25、50 μmol/L;分别吸取100 μL上述溶液放入96孔培养板，每个浓度4个复孔;测每孔的荧光吸光度值，绘制标准曲线.

1.4.3.2 测定3种细菌对PA1—PA5的吸收速度

取1 mL细菌进行离心(9 000g,1 min),倒掉上清液,然后用无菌PBS溶液稀释(OD600=0.6～0.8).取8个离心管，每个离心管中先放入500 μL菌悬液，然后再加入500 μL浓度为25 μmol/L的PA1—PA5溶液并混匀.将这8个离心管分别暗孵育0、10、20、30、40、80、160、320 min，暗孵育完成后，将这8个离心管离心，倾去废液，再用PBS清洗，保留菌团.在上述菌团中加入1 mL裂解液(质量分数1%的SDS溶液)裂解细菌.24 h后吸取100 μL裂解菌液放入96孔板中，酶标仪检测药物荧光OD值(激发波长418 nm，发射波长658 nm)，然后再据标准曲线将测得的OD值转化为药物含量.

1.4.4 PA1—PA5对3种菌株的光动力灭菌作用[10]

用无菌PBS配制化合物PA1—PA5溶液，浓度为31.25、15.6、7.8、 3.9、 0 μmol/L.用无菌肉汤校正细菌浓度为109mL.取上述5个浓度的药液各100 μL依次放入96孔板中，然后每孔再放入100 μL的菌液混匀，放入暗室中孵育30 min.依此步骤再制备1块96孔板.用激光照射其中1块96孔板10 min，能量密度为6 J/cm2.另一块96孔板避光.检测化合物的光毒性及暗毒性.光照后，从每个浓度的药物细菌混合液中都吸取100 μL进行梯度稀释，然后对每一个稀释浓度都进行涂布，每个浓度2个平皿，然后倒置于36 ℃培养箱中，第2天再进行菌落计数.以空白溶剂处理的细菌为对照.按以下公式计算细菌存活率.暗反应组同光反应组但不照光.

细菌存活率=给药组菌落平均值/对照组菌落平均值×100%.

1.4.5 成纤维BALB/c 3T3细胞的毒性检测

取处于对数生长期的BALB/c 3T3细胞于96孔培养板内进行培养，每个孔放入2×104个细胞，后放置于CO2培养箱中培养.24 h后去掉培养基，并用PBS洗涤，其中给药组分别加入不同浓度(50、 25、12.5、 6.25、 3.125、1.56 μmol/L)的PA1—PA5，共6个剂量组，每组设置5个平行孔.对照组加入等体积的空白培养基.然后放于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中暗孵育24 h.24 h后，用能量密度为6 J/cm2的激光器(650 nm)进行照射，照射后继续暗孵育24 h.然后在96孔培养板中每孔加入100 μL的MTT溶液(0.5 mg/mL)，37 ℃培养箱中静置4 h，倒掉上清液，每孔再加入150 μL二甲基亚砜溶剂溶解甲簪颗粒，轻轻振荡.以空白溶剂处理的细胞为对照组，用酶标仪测定光密度值(OD)，计算细胞的存活率.

存活率=给药组平均OD值/对照组OD值×100%.

1.4.6 激光共聚焦显微镜测定3种细菌对化合物PA1—PA5的吞噬[11]

常规培养3种细菌至对数生长期.取上述MRSA,E.coli,P.aeruginosa菌液，离心(9 000g,1 min)，倒掉上清液，用无菌PBS溶液清洗菌团，再重悬菌液至吸光度OD600=0.6～0.8.然后将菌悬液稀释10倍使用.取浓度为25 μmol/L 的PA1溶液500 μL放入无菌试管中，再放入500 μL的稀释MRSA菌液后混匀，然后放置于暗室孵育30 min.孵育完成将试管离心，弃上清液并用PBS重悬菌液，然后用移液枪吸取少许接种在共聚焦培养皿中，晾干.将共聚焦培养皿用激光共聚焦显微镜检测并拍照，观察化合物被3类细菌吞噬的情况.E.coli,P.aeruginosa细菌操作步骤同MRSA.其他4种化合物PA2—PA5的操作方法同上.

2 结果

2.1 5种卟啉类化合物光漂白动力学

评判光敏剂优劣的一个重要指标就是检测其光漂白稳定性.光敏剂的稳定性可以保证PACT的治疗效果.从图1中可以看出，化合物PA1—PA5经过30 min的照射，418 nm处的最大吸收都略有下降，其中PA1下降的最少，约1.9%；PA5下降的最多，约12.3%.化合物PA1具有一定的光稳定性，为其作为光敏剂提供了依据.

a.PA1; b.PA2; c.PA3; d.PA4; e.PA5; f.the absorption spectrum of compounds PA1—PA5.图1 化合物PA1—PA5的光漂白曲线 Fig.1 Photobleaching curve of compound PA1—PA5

2.2 单线态氧产生量的测定

光敏剂被激发后与分子氧结合产生单线态氧的多少直接影响PACT的效果，因而单线态氧产率可以作为考察光敏剂抗菌特性的一个重要指标.同时单线态氧也是光敏剂对靶向目标产生的主要氧化损伤产物，因此监测光敏剂在体外环境产生的单线态氧产率可以预测PACT治疗的效果.通过比较法测定5种卟啉类化合物PA1—PA5的单线态氧，结果如表1所示.从表 1中可以看到在体外环境中光照化合物PA1产生的单线态氧产率(0.69)高于其他4种光敏剂及四苯基卟啉(TPP)(0.64)[12]，可以满足临床光动力治疗的需要.

表1 5种光敏化合物的单线态氧产率

2.3 3种细菌对5种化合物的吞噬速度

从图2中看出，3类细菌对5种化合物的最大吸收峰都发生在前30 min内，30 min以后吸收曲线趋于平稳.鉴于30 min 细菌的吸收能达到最大，故本次实验选择暗孵育的时间为30 min.

2.4 5种化合物光动力抗菌活性

图3中a、c、e表示光照PA1—PA5对3种细菌的灭菌曲线(光反应)，b、d、f表示不用激光照射PA1—PA5对3种细菌的灭菌曲线(暗反应).光照化合物PA1表现出明显的杀菌效果，而光照化合物PA5几乎没有灭菌效果.当PA1浓度增大到31.25 μmol/L时，此时光照PA1几乎全部杀死3种细菌，同时暗毒性也较低.相比于其他4种化合物，PA1对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均有很好的抗菌性能.

图2 MRSA,Escherichia coli和Pseudomonas aeruginosa对PA1—PA5的吸收量Fig.2 Uptake amount of compounds PA1—PA5 by MRSA, E.coli and P.aeruginosa changes against incubation time

a、c、e.6 J/cm2；b、d、f. 0 J/cm2.图3 化合物PA1—PA5的光毒性和暗毒性Fig.3 Photoinactivation of compounds of PA1—PA5

2.5 5种化合物的毒性检测

选用BALB/c小鼠的3T3成纤维细胞来评价5种化合物的光毒性及暗毒性.从图 4中可以看出，5种化合物对成纤维细胞产生的光毒性均高于暗毒性.而且PA1—PA5对成纤维细胞的光毒性随着剂量的增加而增加，达到最大浓度(31.25 μmol/L)时，成纤维细胞的存活率分别为10.6%、10%、11%、0.4%和13%，而在此浓度作用下，MRSA、E.coli和P.aeruginosa3种细菌的存活率约为0，几乎全部被灭活.

2.6 激光共聚焦检测PA1—PA5在3种细菌中的吞噬情况

光敏剂能否被细菌吞噬并进入到细菌内部对其PACT疗效非常关键[13].将光敏剂PA1—PA5与3种细菌悬液混匀并暗孵育30 min，然后用激光共聚焦显微镜显示化合物被3种菌株吞噬的情况.光敏化合物被细菌吞噬后进入细菌体内再受到激发就会产生红色荧光.图5显示化合物PA1发出的红色荧光最强，表明PA1被3种菌吞噬的最多，PA2的红色荧光也较强，说明被3种菌吞噬的也较多，而PA3、PA4、PA5中红色荧光最弱,间接表明体内仅有少量光敏剂进入.说明3种细菌对PA1—PA5的吸收具有选择性.

a.6 J/cm2；b.0 J/cm2.图4 化合物PA1—PA5的毒性Fig.4 Photoinactivation of compounds of PA1—PA5 for BALB/c 3T3 cell

a.E.coli; b.MRSA; c.P.aeruginosa.图5 PA1—PA5被3种细菌的吞噬情况Fig.5 Confocal laser scanning microscopic images of (a)Escherichia coli (b) MRSA (c)Pseudomonas aeruginosa

3 讨论

人类为了有效灭活耐药菌株，需要抗生素的量越来越大，使得药物的副作用大大增加，导致了正常菌群被抑制或杀灭,增加了由病原微生物导致的多种感染性疾病的发病率.光动力抗菌化学疗法(PACT)是将激光技术、光化学技术和医学技术有机结合的新产物，使病原菌很难产生耐药性[3].光敏剂具有光活性及强抗菌能力，可以选择性地聚积在靶向组织内，通过激光激发靶细胞，释放光化产物杀死靶细胞，达到杀菌的目的[14].卟啉化合物是一类具有特殊生物功能的化合物，是构成叶绿素、血红蛋白等大分子的主要成分，参与生物体内一系列的重要过程，在新陈代谢中起着重要的作用.

本实验室在卟啉结构周边引入多氨基极性基团合成了一系列新型光敏剂PA1—PA5.实验结果表明，光敏剂PA1有很强的单线态氧产生能力,且具有一定的光稳定性.体外抑菌实验显示PA1对3种细菌具有明显的杀菌效果，当PA1浓度上升为31.25 μmol/L时，对3种细菌的灭活率达100%.而在此浓度范围内PA1对BALB/c成纤维细胞的损伤却较小.激光共聚焦显微镜也显示被3种细菌吞噬的光敏化合物PA1受到激发而产生较强的红色荧光，提示PA1能够进入细菌内部.以上结果表明光敏剂PA1介导的PACT对MRSA、E.coli和P.aeruginosa3种细菌的抗菌作用较强，作为新型抗菌光敏剂的使用具有良好的前景.PACT杀伤细菌的机制目前还处在猜测之中,有研究认为光敏剂在特定波长光的激发下，产生多种活性氧簇,损伤病菌质膜[15]或导致病菌DNA损伤[16]，达到治疗的目的.但新型光敏剂PA1的灭菌机制还需要进一步的研究来证实.

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(责任编辑：赵藏赏)

Invitrostudy on antimicrobial activity of new water-soluble porphyrin photosensitizers

ZHAO Zhanjuan1,GENG Wenyi2,FAN Ziyu1,HONG Ge3,LIU Tianjun3

(1.Medical College, Hebei University, Baoding 071002, China; 2.Medical College, Jinan University,Guangzhou 510632, China;3.Key Laboratory of Biomedical Mater of Tianjin,Institute of Biomedical Engineering, Chinese Academy of Medical Sciences,Tianjin 300192,China)

The aim of this study is to investigate the photodynamic antibacterial activity of new porphyrin-based photosensitizers, and provide the experimental basis for the application of photodynamic antibacterial in clinic.Three strains were culturedinvitroMRSA,Escherichiacoli, andPseudomonasaeruginosa, respectively,and the uptake of five compounds(PA1—PA5) by three bacteria was tested.The light reaction and dark reaction concentration curves of the PA1—PA5 against three bacteria were determined by colony counting method, and laser confocal microscopy was used to detect bacterial phagocytosis of photosensitizers.All of the five porphyrins had relatively slow photobleaching rate and strong singlet-state generation ability.The results of laser confocal microscopy also showed that the three types of bacteria were selective for the uptake of PA1—PA5.PA1 showed significant bactericidal properties compared to the other four photosensitizers.With irradiation PA1 on three bacteria,the inactivation rate was 100%,when the concentration was increased to 31.25 μmol/L.PA1 as a new type of antibacterial photosensitizer shows a broad prospect as it shows the best effect on photodynamic sterilization of three bacteria.

photodynamic antimicrobial chemotherapy; wound infection; photosensitizer;porphyrin derivative

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.04.010

2016-09-02

河北大学医学学科建设项目(2015A2001)；中西部高校综合实力提升工程专项经费；天津市生物医学材料重点实验室开放性课题

赵占娟(1974—)，女，河北博野人，河北大学副教授，博士，主要从事激光医学研究. E-mail: zhaozhanjuanv@163.com

刘天军(1965—)，男，河南辉县人，中国医学科学院生物医学工程研究所研究员，博士生导师，主要从事分子设计方面的研究.E-mail：liutianjun@hotmail.com

O43；Q631；R641

A

1000-1565(2017)04-0393-07