河北大花蕙兰疫病病原鉴定及其生物学特性分析

李小六，李艳梅，李 萍，范永山

(1.唐山幼儿师范高等专科学校，河北 滦县 063700； 2.唐山师范学院 生命科学系，河北 唐山 063000)

河北大花蕙兰疫病病原鉴定及其生物学特性分析

李小六1，李艳梅2，李 萍2，范永山2

(1.唐山幼儿师范高等专科学校，河北 滦县 063700； 2.唐山师范学院 生命科学系，河北 唐山 063000)

为了明确大花蕙兰疫病的发生机制，对河北地区引起大花蕙兰疫病的病原菌进行分离、纯化、鉴定和接种试验，并对大花蕙兰疫病的病原菌进行生物学特性分析。结果表明，河北大花蕙兰疫病的病原菌为掘氏疫霉(Phytophthoradrechsleri)，有伤接种3 d后即可以产生典型疫病症状。病原菌的适应能力较强，在24～32 ℃和pH值4.0～10.0条件下均能正常生长，其最适生长温度为28 ℃，最适pH值为7.0。在V8培养基、查氏培养基和CA培养基上均生长良好，但在PDA培养基上生长较差。在无菌水中连续光照培养2 d即可诱导产生大量孢子囊和孢囊孢子。孢囊孢子保湿12.0 h萌芽率即可达90.0%以上，适宜萌芽温度为20～40 ℃，最适萌芽温度为30 ℃，适宜萌芽pH值为4.0～9.0，最适pH值为7.0。以上研究表明，河北地区大花蕙兰疫病病原菌具有较强的致病力和环境适应能力。

大花蕙兰疫病； 病原鉴定； 掘氏疫霉； 生物学特性

大花蕙兰(Cymbidiumhybridium)，又叫虎头兰、喜姆比兰和蝉兰，属于兰科兰属多年生草本植物。自1889年英国培育出第1个大花蕙兰品种以后，欧美和亚洲等地也相继选育出大量的种间和品种间杂种。至今，大花蕙兰的栽培品种已有近2万个，成为兰花中的庞大品种群，在国内外花卉市场十分畅销，是国际上五大盆栽兰花之一[1-3]。自20世纪90年代河北地区引进种植大花蕙兰以来，其在栽培过程中由于生长环境温暖潮湿，极易感染疫病。大花蕙兰疫病主要危害幼苗和成株的茎基部、叶片，其中心叶最易受到伤害。该病一旦发生如不及时处理，则很快传染到根茎、球茎，造成毁灭性的伤害[4]。在生产上,防治大花蕙兰疫病的方法主要是化学防治，然而防治效果并不显著，主要原因是对大花蕙兰疫病的发生机制了解不清楚。病原菌鉴定和生长特性分析是澄清病害发生机制的前提条件。但是，目前对大花蕙兰疫病病原菌的研究较少，唐祥宁等[5]和秦建彬等[6]分别认为棕榈疫霉(Phytophthorapalmivora)是上海地区和福建地区大花蕙兰疫病的主要病原菌，而陈永强等[7]认为柑橘生疫霉(P.citricola)和烟草疫霉(P.nicotianae)也能引起广州地区的大花蕙兰疫病。由此可见，由于生态条件不同，引起大花蕙兰疫病的病原菌可能会不同。河北地区是我国北方大花蕙兰的主要产区，由于生态和气候条件与上海、福建和广州等南方地区差别较大，因此，大花蕙兰疫病的发病机制可能也与南方地区不同。鉴于目前尚无关于河北地区大花蕙兰疫病发生发展研究的报道，本研究将在对河北地区大花蕙兰疫病病原菌进行鉴定的基础上，分析大花蕙兰疫病病原菌的生物学特性，为阐明河北地区大花蕙兰疫病的发病机制以及后续的防治技术研究提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 大花蕙兰 由唐山师范学院兰花培育基地生产的大花蕙兰作为本研究的试验材料。

1.1.2 培养基 采用方中达[8]的方法配制V8培养基、查氏培养基、PDA培养基和CA培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 大花蕙兰疫病病原菌的分离、纯化和鉴定 参照秦建彬等[6]的试验方法进行大花蕙兰疫病病原菌的分离、纯化和鉴定。选取具有典型疫病症状的病叶，用水洗净切块，然后用70%乙醇表面消毒10 s，无菌水冲洗2次后转移到CA培养基平板上，28 ℃培养48 h，挑取边缘菌丝体进行纯化培养2代，获得大花蕙兰疫病病原菌的纯培养菌株。将纯培养菌株接种在CA平板上28 ℃下培养7 d，观察菌落生长情况，显微观察孢囊梗、孢子囊、孢囊孢子等无性繁殖器官的形态特征，观测藏卵器和卵孢子的直径及雄器的着生方式和大小。按照余永年[9]的鉴定标准对获得的纯培养菌株进行鉴定。

1.2.2 孢子囊制备和致病性鉴定 将纯培养菌株接种在CA培养基平板上，于28 ℃下培养5 d，用直径5 mm的打孔器打取菌盘，置于带有无菌水的培养皿中，28 ℃连续日光灯光照48 h，镜检孢子囊的产生数量，并制备孢囊孢子浓度为4×103个/mL的孢子囊悬浮液。取50 μL孢子囊悬浮液接种健康无伤的大花蕙兰新叶，分为4种接种方式：无伤接种、刺伤接种(用解剖针刺伤叶片表皮接种)、剪伤接种(用消毒后的剪刀剪伤叶片后在伤口处接种)和磨伤接种(取少量细石英砂放在大花蕙兰叶片上，用镊子夹取灭菌后的脱脂棉轻轻摩擦，在微伤口处接种)；以清水处理为空白对照。每个处理10株。接种后28 ℃保湿培养，3 d后开始观察发病情况，5～10 d后剪取出现典型疫病症状的病叶，取病健交界处分离、纯化，将获得的纯培养菌株与原接种菌株进行一致性比较，明确是否为同一种病原菌。

1.2.3 病原菌的生物学特性分析

1.2.3.1 生长温度对菌丝生长的影响试验 打取直径5 mm的菌盘移入CA培养基平板上，分别在20、24、28、32、36、40 ℃恒温箱中培养7 d，观测温度对病原菌生长情况的影响。

1.2.3.2 培养基pH值对菌丝生长的影响试验 用10%NaOH和10%HCl调节CA培养基的pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，接种菌盘后28 ℃恒温培养7 d，观测培养基pH值对病原菌生长情况的影响。

1.2.3.3 培养基种类对菌丝生长的影响试验 在pH值7.0的V8培养基、查氏培养基、PDA培养基和CA培养基中央分别接种直径5 mm的菌盘，28 ℃恒温培养7 d，观测培养基种类对病原菌生长情况的影响。

1.2.3.4 不同因素对孢囊孢子萌芽的影响试验 用接种环挑取少许于CA培养基上培养7 d的菌丝，接入V8培养液中，28 ℃、120 r/min振荡培养48 h，用无菌移液管取出1 mL菌悬液，无菌水稀释1 000倍，用滴管吸取孢子悬液到凹玻片的凹槽中，置培养皿内保湿培养，镜检并统计孢囊孢子萌芽率。分析保湿时间(0.5、6.0、12.0、24.0 h)、孢子悬液pH值(2.0～12.0)、保湿温度(10～90 ℃)对孢囊孢子萌芽的影响。每个处理重复5次。

1.3 数据统计分析

利用IBM SPSS 19软件对数据进行ANOVA方差分析。

2 结果与分析

2.1 河北地区大花蕙兰疫病病原菌鉴定

从河北地区大花蕙兰疫病病株上分离纯化后获得的纯培养菌株在CA培养基上生长良好，菌落淡粉色(图1A)，背面观为黄褐色(图1B)，气生菌丝中等旺盛。在显微镜下观察，菌丝无分隔，宽5.8～7.3 μm；菌丝体分枝较多，无规则，分枝大部分为锐角；常形成结节状或不规则的菌丝膨大体，菌丝膨大体常串生(图1C)。菌丝块置于无菌水中连续光照培养2 d，产生大量孢子囊。孢囊梗不分枝或简单合轴分枝，孢子囊无乳突且不从孢囊梗上脱落，孢子囊卵圆形、长椭圆形或椭圆形，长35～95 μm，宽23～45 μm(图1D)。孢子囊内生3～6个孢囊孢子，长12～16 μm，宽9～14 μm。观测到病菌的有性繁殖器官，其藏卵器圆形，壁光滑，基部棍棒状，直径22～45 μm；卵孢子不满器，直径15～32 μm；雄器围生，长15～36 μm，宽8～22 μm(图1E)。

A.菌落正面；B.菌落背面；C.菌丝膨大体；D.孢子囊；E.藏卵器和雄器图1 河北地区大花蕙兰疫病病原菌的生物学特征

对获得的纯培养菌株进行致病性测定，结果发现，刺伤接种、剪伤接种和磨伤接种同时在第3天开始发病，伤口处布满淡粉色的菌丝体，在创口边缘出现黑褐色腐烂现象(图2A)，而无伤接种不表现任何症状(图2B)；接种10 d时，刺伤接种、剪伤接种和磨伤接种的腐烂范围不断向叶片两边扩展(图2C)，而无伤接种则刚开始表现症状，心叶上出现黑褐色小斑点；接种20 d时，刺伤接种、剪伤接种和磨伤接种的腐烂面积扩大，染病部位明显缢缩(图2D)，无伤接种的整个心叶呈黑褐色腐烂状态，在心叶周围的叶片上也出现黑褐色小斑点，且有的几个小斑点连成一片成为大斑点。从每种处理发病叶片的病健交界处重新分离纯培养菌株，其与初始接种菌株在CA培养基上的菌落特征和孢囊梗、孢子囊、孢囊孢子、藏卵器、卵孢子、雄器的形态完全一致。

以上研究结果表明，试验中分离获得的纯培养菌株为河北地区大花蕙兰疫病的病原菌。按照余永年[9]的鉴定标准对该病原菌进行鉴定，该病原菌为鞭毛菌亚门卵菌纲霜霉目疫霉属掘氏疫霉(Phytophthoradrechsleri)。

A.伤口接种3 d；B.无伤接种3 d；C.伤口接种10 d；D.伤口接种20 d图2 河北地区大花蕙兰疫病病原菌的致病性鉴定

2.2 河北地区大花蕙兰疫病病原菌的生物学特性分析

2.2.1 不同因素对菌丝生长的影响

2.2.1.1 生长温度 河北地区大花蕙兰疫病病原菌的适宜生长温度为24～32 ℃，28 ℃下生长最好，菌落直径达到85.5 mm(图3A)。低于24 ℃和高于32 ℃均生长缓慢，菌丝稀疏，颜色变暗。

2.2.1.2 培养基pH值 河北地区大花蕙兰疫病病原菌在pH值4.0～10.0内均可正常生长，适宜范围较广，最适生长pH值为7.0，菌落直径达到87.0 mm(图3B)。

图3 生长温度(A)和培养基pH值(B)对病原菌生长的影响

2.2.1.3 培养基种类 河北地区大花蕙兰疫病病原菌在V8培养基、查氏培养基和CA培养基上生长状况均良好，7 d后菌落直径都可以达到85.0 mm，而在PDA培养基上生长情况较差。菌落颜色在不同培养基上有所不同：在V8培养基上菌落正面呈粉色，背面呈红棕色；在CA和PDA培养基上菌落正面呈淡粉色，背面呈黄褐色；在查氏培养基上菌落正面呈白色，背面呈浅黄色。

2.2.2 不同因素对孢囊孢子萌芽的影响

2.2.2.1 保湿时间 保湿0.5 h后约有2%的孢囊孢子产生芽突，6.0 h后萌芽率接近16%，12.0 h萌芽率即达90%以上，保湿24.0 h时所有孢囊孢子均萌芽，且部分芽管长达600～800 μm，并有多个分枝。孢囊孢子有基部萌芽和两端萌芽2种方式，以基部萌芽为主，约占90%，一个孢子最多可萌生出2个芽管。

2.2.2.2 保湿温度 孢囊孢子在10～30 ℃内萌芽率逐渐升高，但高于30 ℃后萌芽率逐渐下降，到达50 ℃时萌芽率降低到68.7%，90 ℃时未见孢囊孢子萌芽(图4A)。因此，孢囊孢子的适宜萌芽温度为20～40 ℃，最适萌芽温度为30 ℃，致死温度为90 ℃。

2.2.2.3 孢子悬液pH值 在pH值4.0～9.0内孢囊孢子均有较高的萌芽率，其最适pH值为7.0，此时萌芽率为98.1%。pH值低于4.0和高于9.0时萌芽率均显著下降(图4B)。

图4 生长温度(A)和孢子悬液pH值(B)对孢囊孢子萌芽的影响

3 结论与讨论

兰花疫病是世界性兰花病害之一，不但可以危害大花惠兰、卡特兰、蝴蝶兰等洋兰，还可以危害墨兰、东亚兰等30余种国兰及300余种观赏植物[10]。因此，兰花疫病的危害极大，直接影响兰花的品质和产量，造成极大的经济损失。大花惠兰作为著名的“兰花新星”，在国内外花卉市场十分畅销，深受花卉爱好者的倾爱。但是，由于雾霾天气频发和大气变暖等原因，大花蕙兰疫病的发生越来越严重，已成为限制大花蕙兰生产的主要病害之一。然而，由于引起大花蕙兰疫病的病原菌种类多、差异大，不同地区、不同生态环境下该病的发生发展机制可能不同。本研究结果表明，河北地区大花蕙兰疫病的病原菌为掘氏疫霉(Phytophthoradrechsleri)，与上海[5]、福建[6]和广州[7]等地区的病原菌均不同。

掘氏疫霉是一种广谱致病菌，可以危害茄果类、瓜类、棉花、苹果、梨、枸杞、草莓、红花、白术等多种农作物[11-13]，但是其在兰花上致病，本研究为首次报道。该病菌的致病性非常强，为寄生性病菌，它的菌丝体多在寄主细胞间隙扩展并产生吸器进入寄主细胞内吸收养分[14]。本研究明确了该病原菌的生长特性和孢囊孢子萌芽的影响因素，为进一步阐明该病的侵染机制奠定了理论基础。

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Pathogen Identification and Biological Characteristics ofCymbidiumhybridiumBlight in Hebei Province

LI Xiaoliu1，LI Yanmei2，LI Ping2，FAN Yongshan2

(1.Tangshan Preschool Teachers College,Luanxian 063700,China; 2.Department of Life Science,Tangshan Normal University,Tangshan 063000,China)

In order to clarify the occurrence mechanism ofCymbidiumhybridiumblight,the pathogen was isolated,purified,identified,and re-inoculated in Hebei province.The biological characteristics of the pathogen were analyzed at the same time.The results showed that the pathogen ofCymbidiumhybridiumblight in Hebei province was identified asPhytophthoradrechsleri,which could produce typic blight symptom after 3 days of wound inoculation.The pathogen was strongly adaptive to environment and could grow well at 24—32 ℃ and pH 4.0—10.0.The optimal growth temperature and pH value of the pathogen was 28 ℃ and 7.0 respectively.The pathogen could grow well in the V8 medium,Chavez medium and CA medium,but poor in PDA medium.A large number of sporangia and sporangiospores could be easily induced after 2 days of continuous illumination in autoclaved water.The germination rate of sporangiospores was above 90.0% after 12.0 h of moisture culture.The sporangiospore could germinate very well at 20—40 ℃ and pH 4.0—9.0.The optimal temperature and pH value of sporangiospore germination were 30 ℃ and 7.0 respectively.The above results indicated that the pathogen ofCymbidiumhybridiumblight in Hebei province possessed strong pathogenicity and environmental adaptivity.

Cymbidiumhybridiumblight; pathogen identification;Phytophthoradrechsleri; biological characteristics

2017-01-12

唐山师范学院科技发展项目(2014E04,2013A03,2016C05)

李小六(1971-)，男，河南确山人，副教授，硕士，主要从事微生物学研究。E-mail：1274390449@qq.com

S436.8+1

A

1004-3268(2017)08-0083-04