某规模化肥育猪场呼吸道疾病的诊断与防控

2017-09-01陈同煜秦四海王玉超古金元胡东方刘思当

养猪 2017年4期

关键词：肥育耳病氏杆菌

陈同煜，秦四海，彭涛，王玉超，古金元，胡东方，刘思当

（1.山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271000；2.临沂大学生命科学学院，山东临沂 276000）

某规模化肥育猪场呼吸道疾病的诊断与防控

陈同煜1，秦四海2，彭涛1，王玉超1，古金元1，胡东方1，刘思当1

（1.山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271000；2.临沂大学生命科学学院，山东临沂 276000）

山东某规模化肥育猪场于2016年12月通过长途运输购进某种猪公司60日龄左右的仔猪1 000多头，进场1周猪群即出现咳嗽、气喘、发热并伴有拉稀病症，发病率20%，病死率10%，是一起传播迅速的急性呼吸道病疫情。通过病死猪剖检诊断、细菌分离鉴定、组织病理学检查、酶联免疫吸附试验和分子生物学检测，确诊为一起由应激继发的呼吸道细菌感染，并导致猪群对重要病毒病抵抗力下降。通过药敏试验选择敏感药物，对猪群实施了合理的药物防治，并对相关病毒性疾病进行了免疫，该猪场疫情得以迅速控制，避免了重大的经济损失。

猪；呼吸道疾病；诊断；防控

猪呼吸道疾病是危害猪场稳定生产的首要疾病，因其致病因素复杂，涉及细菌、病毒、支原体、寄生虫、不良环境及饲养管理等众多因素，往往难究其根源，称为呼吸道病综合征（PRDC）。随着疫苗制品质量的提高和养殖户免疫意识的增强，猪场病毒性疾病的防控效果越来越好，但却忽视了细菌性疾病对猪呼吸道的危害。近年来猪场PRDC频发，尤其是许多中小规模猪场或散养户，由于引种或外购仔猪肥育使该病的发生风险显著增加，多数猪场在购猪1个月内即出现不同程度的疫情。通过多起病例检测发现，在危害猪呼吸道的细菌性疾病病原中，支原体、副猪嗜血杆菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌以及巴氏杆菌占据了主导位置，该类病菌通常条件下以隐性感染居多，在冷热交替、天气突变、长途运输或饲料改变等应激状态下易诱发PRDC，常混发或并发病毒性疾病使病情复杂化。下面介绍一起规模化专业肥育猪场呼吸道病的诊断与防治，为猪场呼吸道疾病的诊断防控提供参考。

1 发病背景

山东省某规模化专业肥育猪场于2016年12月1日远距离引进某种猪公司1 600头20～30 kg保育猪肥育，进场1周后猪群即出现部分仔猪发烧（体温升高达39.5～40.5℃）、咳嗽、气喘并伴有拉稀病症，有的病猪表现为耳朵发绀、被毛粗乱、消瘦，以呼吸道病症状最为明显，短时间内发病率高达20%，病死率10%，保育猪前期免疫程序不明。发病后紧急投服氟苯尼考、阿莫西林及柴胡注射液中药针剂，效果不佳，遂前往实验室就诊。

2 综合诊断

2.1 病猪临床检查

送检病猪主要表现为咳嗽、气喘，呈明显腹式呼吸，被毛粗乱、精神沉郁、瘦弱、耳朵发绀等。

2.2 剖检病变

下颌及肺门淋巴结肿大出血，腹股沟及肠系膜淋巴结显著肿大（图1-A）；肺脏硬实暗红色肿胀，小叶间质水肿增宽，有的被膜附有纤维蛋白渗出物（图1-B）；有的发生纤维素性心包炎，心脏呈“绒毛心”样变（图1-C）；胸腔、腹腔积液（图1-D、图1-E）；肝脏淤血并附有纤维素性渗出物；有的病猪结肠黏膜出血、溃疡（图1-F）。

图1 病猪剖检病变

2.3 组织病理学病变

对剖检猪的淋巴结、脾脏、肾脏、心脏、肺脏、脑组织采样，用10%中性福尔马林溶液固定，常规方法制作石蜡切片，H.E染色，镜检。结果可见淋巴结毛细血管充血、浆液渗出，呈浆液性淋巴结炎病变（图2-A）；脾脏充血、出血，呈败血脾病变（图2-B）；肺间质充血，肺泡内大量浆液、纤维素渗出，呈大叶性肺炎病变（图2-C）；肾间质淤血、肾小管上皮细胞变性坏死（图2-D）；心肌纤维呈现空泡变性（图2-E）；脑血管充血，神经元空泡变性、坏死（图2-F）。

图2 病猪组织病理学变化

2.4 病原学和血清学检查

因该场猪群发病率和死亡率均较高，首先怀疑是否有蓝耳病野毒感染，除对病死猪剖检，采集脑、脾脏、肝脏、肾脏、淋巴结及扁桃体组织液氮保存，同时随机采集发病猪群血清18份离心，-20℃备存。将冻存于液氮中的组织病料解冻后取适量组织加入灭菌PBS液并研磨成匀浆，9 000 r/min离心4 min，取上清液，同时18份血清每份吸出20 μL折合1份样品，使用北京全式金EasyPure Viral DNA/RNA kit（批号为K10314）提取病毒核酸。根据GenBank中公布的序列设计猪蓝耳病病毒片段为372 bp的特异性引物（表1），用PCR/RT-PCR方法扩增，将扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，紫外凝胶成像仪下据条带位置判定病猪的病原感染状况，结果显示，病料和血清中蓝耳病病毒均为阴性（图3）。

表1 蓝耳病病毒引物序列

图3 PRRSV 1.5%琼脂糖凝胶电泳结果

使用韩国金诺试剂盒对备存血清进行猪瘟病毒、蓝耳病病毒、伪狂犬病病毒gE、圆环病毒2型抗体水平检测，4种病毒检测均按照说明书步骤严格规范操作。判定标准是猪瘟病毒（CSFV）：阻断率≥40%为阳性；阻断率＜40%为阴性。猪蓝耳病病毒（PRRSV）：S/P值≥0.40为阳性；S/P值＜0.40为阴性。猪伪狂犬病病毒gE（PRV gE）：S/N≤0.6为阳性；S/N＞0.6为阴性。猪圆环病毒2型（PCV2）：S/P≥0.4为阳性；S/P＜0.3为阴性，之间为可疑。检测结果见表2。

表2 4种病毒血清抗体检测结果

由表2可知，部分猪只猪瘟抗体检测结果为阴性，且均匀度较差，猪瘟免疫状态差，发病风险较大。蓝耳病病毒抗体全部阳性且离散度大，结合病原检测结果和临床发病情况推知该外购仔猪群很可能免疫过蓝耳病疫苗，导致蓝耳病病毒抗体离散度不均是因为少数或部分弱猪抗体水平差，另外长途运输应激也是导致猪只体内抗体水平参次不齐的一个因素，说明蓝耳病病毒在猪群中有一定的活跃度，存在发病风险。伪狂犬病病毒gE抗体阳性率较高，虽病猪未表现神经症状，但严重的呼吸道病症状与之不无关系。圆环病毒2型抗体几乎全部阳性，由于该猪群免疫过1次圆环病毒疫苗，鉴于发病猪腹股沟及肠系膜淋巴结显著肿大，不能排除猪群存在圆环病毒感染，导致猪只体质下降，从而促使呼吸道疾病的发生。

2.5 细菌分离鉴定及药物敏感试验

采集不同病猪肺组织分别划线接种于含新生牛血清（终浓度10%）和NAD（终浓度20 g/mL）的TSA培养基及鲜血琼脂平板上，37℃培养24～48 h后TSA培养基可见针尖大小、无色透明、光滑湿润的菌落形态，鲜血琼脂平板可见淡灰色、圆形、湿润、露珠样小菌落。革兰氏染色镜检，观察到TSA培养基菌体呈革兰氏阴性细小杆菌，有多种不同形态，从单个球杆菌到细丝杆菌不等（图4）；鲜血琼脂平板菌体为革兰氏阴性短杆菌或球杆菌，散在或成双（图5）。初步诊断疑似副猪嗜血杆菌（HP）与巴氏杆菌（PM）混合感染。同时，挑取细小单菌落接种于含新生牛血清（终浓度10%）和NAD（终浓度20 g/mL）的TSB液体培养基中进行增菌，37℃12 h后挑取菌液进行副猪嗜血杆菌和巴氏杆菌特异性PCR鉴定（表3）。结果显示，该猪群存在副猪嗜血杆菌和巴氏杆菌混合感染（图6）。

表3 副猪嗜血杆菌和巴氏杆菌引物序列

图4 副猪嗜血杆菌分离菌株革兰氏染色（200×）

图5 巴氏杆菌分离菌株革兰氏染色（200×）

图6 HPS和PM 1.5%琼脂糖凝胶电泳结果

分别挑取副猪嗜血杆菌和巴氏杆菌及培养基其他形态菌落均匀涂布于新鲜血琼脂平板上，选取头孢噻呋钠、强力霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、阿莫西林、庆大霉素、丁胺卡那霉素、磺胺间甲氧嘧啶8种药敏片，每片药物含量10 μg，用无菌镊子将药敏片按一定间隔分别平贴于培养基表面，于37℃二氧化碳培养箱中培养24 h。根据抑菌圈直径（φ）判定细菌对药物的敏感程度，判定标准为：φ≥25 mm为极度敏感；15 mm≤φ＜25 mm为高度敏感；10 mm≤φ＜15 mm为中度敏感；φ＜10 mm为低度敏感；无抑菌圈则为耐药。结果显示：细菌对头孢噻呋钠、恩诺沙星极度敏感，对丁胺卡那霉素、庆大霉素、磺胺间甲氧嘧啶高度敏感，对氟苯尼考、阿莫西林中度敏感，强力霉素低度敏感（表4）。

表4 药敏试验结果

3 疾病诊断

综合分析实验室检测结果，导致本次疫情的主要原因是长途运输应激诱发的以副猪嗜血杆菌和巴氏杆菌为主的细菌急性感染、以大叶性肺炎为主要病变特征的重症PRDC，且不排除支原体、传染性胸膜肺炎放线杆菌及魏氏梭菌的参与。另外，冬季寒冷、猪舍饲养密度大、通风不良也是引发本次疫情的重要原因。因猪群运输应激并造成了呼吸道细菌性疾病的暴发，进而造成对蓝耳病、猪瘟、伪狂犬病抵抗力下降，猪群存在暴发上述疫病的风险很大。