我国猪流行性腹泻流行现状分析及变异毒株鉴别检测方法研究进展

祖立闯，谢金文，王金良，李 峰，沈志强，

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

我国猪流行性腹泻流行现状分析及变异毒株鉴别检测方法研究进展

祖立闯1，谢金文2，王金良2，李 峰2，沈志强1，2

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的以仔猪呕吐、腹泻、脱水、死亡为主要特征的一种急性、高度接触性、病毒性肠道传染病[1-2]。该病于1971年在英国被首次报道，随后在日本、德国和比利时等许多国家均有报道，我国于1983年首次发现该病[3]，随后开始在我国呈散发性、区域性流行，其流行和危害程度得到了一定的控制。但自2010年末开始，我国猪场陆续暴发了由PEDV变异毒株引起的以新生仔猪严重呕吐、水样腹泻、肠道出血和高病死率为主要特征的“顽固性腹泻”疫情[4-5]，引起了业界的广泛关注，甚至普遍认为变异型PED将是未来几年内危害仔猪最为严重的腹泻病之一。为全面掌握目前我国猪群中PED流行现状，笔者查阅2010年变异毒株开始流行以来我国在PEDV毒株分离鉴定、流行病学监测、遗传变异等方面研究资料，整理与分析出了目前我国PEDV的流行现状与流行特点，并综述了PEDV变异株的鉴别检测方法，对目前我国PED的防控具有一定的参考价值。

1 病毒分离鉴定情况

如表1所示，对2010年至今国内PEDV野毒株的分离鉴定情况进行汇总分析，呈现出以下几个显著特点。

1.1 分离鉴定率高

2011—2016年，6年时间里国内共分离鉴定出PEDV野毒株高达38株，平均6.33株/年，病毒分离鉴定率较高。

1.2 变异毒株成为优势毒株

在38株PEDV野毒株中有28株完成了毒株类型的鉴定，而这完成了毒株类型鉴定的28株均为变异毒株，变异株已成为当前PEDV的流行优势毒株。

1.3 分离范围广

38株PEDV野毒株覆盖了福建、江苏、四川、上海、广东、河北、山东、安徽、云南、新疆、内蒙古、吉林、青海、贵州、北京、湖北、甘肃、山西、浙江、陕西、江西等21个省市，呈全国性流行。

1.4 由南向北、由沿海向内陆逐步流行

病毒开始由福建、江苏、四川、广东向安徽、上海、山东、河北流行，随后逐步流行至北京、吉林、内蒙古。

表1 2010年以来PEDV野毒株分离鉴定情况汇总

2 流行病学监测情况

随着PEDV变异毒株的日益流行，以及我国对PEDV感染的逐步重视，我国研究学者对不同地区的PEDV感染情况进行了大量的流行病学监测。如表2所示，自2010年以来，我国猪场PEDV阳性感染率一直居高不下，区域性流行特点显著，如2012—2013年四川的感染率高达86.67%，2014—2015年山西的感染率达73.26%，2015—2016年黑龙江、吉林、辽宁等3省的感染率达74.62%。PEDV在我国猪群中已广泛流行，且在个别地区感染率较高，感染情况比较严峻，应加强重视。

表2 2010—2017年PEDV流行病学监测情况汇总

3 遗传变异分析情况

对病毒进行遗传变异分析可以从分子水平发现PEDV流行病毒株之间的差异以及遗传和衍化规律，明确PEDV不同时间、不同地区流行毒株的基因亚型与变异情况，能够为寻找病毒的传播路径以及为不同地区因地制宜的制定防控措施提供指导。吴旺霞等[5]对浙江省2011—2016年PEDV流行毒株与疫苗株的S基因和ORF3基因进行了RT-PCR扩增、克隆及测序，并对其序列变异、遗传进化和抗原位点进行分析。基因变异分析结果显示，与国内疫苗株CV777相比，流行毒株S基因存在15个核苷酸插入和6个核苷酸缺失，导致氨基酸序列存在5个氨基酸插入（58QGVN61和140N）和2个氨基酸缺失（163DI164），且在主要突变区S1区的2个中和表位（499-638和764-771 aa）有8处氨基酸突变，且ORF3基因有7处氨基酸变异。遗传进化分析结果显示，流行毒株S基因与亚洲主要疫苗株（国内疫苗株CV777和韩国弱毒疫苗株DR13）的同源性仅为93.3%～94.9%，而与2011—2016年中国流行株（BJ-2011和Hu N）的同源性高达97.8%～99.9%，表明PEDV已呈现较大程度的遗传变异。王飞等[53]对2014—2015年分离的9株PEDV毒株的S基因进行克隆和测序，并将其分别与疫苗株、中国2010年前经典毒株、中国2010—2013年出现的毒株及韩国、美国近年来流行毒株进行S基因序列比对、分析。结果显示，9株PEDV S基因核苷酸同源性为98.4%～99.5%，与疫苗株和中国2010年前经典毒株相比核苷酸同源性为93.4%～96.2%，与中国、韩国、美国近年来暴发的毒株相比核苷酸同源性为97.4%～99.2%，现阶段PEDV S基因已发生较大变异，存在高度相似的缺失，插入和变异，且在中和表位区域存在多处变异。遗传进化树显示，我国常用的疫苗毒株CV777处于G1组，这9株毒株S基因均位于G2组，说明我国当前流行毒株与疫苗株和早期经典毒株的亲缘性相去较远。表明我国PEDV流行毒株以变异株为主，变异毒株的抗原位点、糖基化位点和跨膜螺旋较以往的疫苗株发生了较大变异，提示PEDV在近年呈现快速变异和进化的趋势，常规疫苗有可能无法提供良好的免疫保护，需要开发新型疫苗以及制定更具针对性的防控措施来控制PEDV的流行与暴发。

4 变异株鉴别检测方法

通过对PEDV流行毒株的分离鉴定以及遗传变异分析表明PEDV变异毒株目前是我国的优势流行毒株，且其感染率较高。PEDV变异毒株感染应该是造成我国目前PED疫苗免疫失败和仔猪高致死率的主要原因，亟待建立可以准确区分PEDV变异毒株的鉴别诊断方法。对于PEDV变异毒株的鉴别诊断，主要依靠基于PEDV变异毒株、经典毒株、疫苗毒株核酸序列差异的分子生物学方法和基于高特异性单克隆抗体的血清学方法。本文综述了PEDV变异株的鉴别诊断方法，以期对PEDV变异株感染进行早期快速、准确诊断，淘汰净化变异毒株感染猪，为制定PED综合防控措施提供依据。

4.1 RT-PCR方法

RT-PCR首先以病毒的基因组RNA为模板进行反转录合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，能检测到病原体特有的核苷酸序列，是疾病病原检测中最常用的一种分子生物学诊断技术。多重RT-PCR方法是在单一RT-PCR检测方法的基础上建立起来的，可在同一个反应体系中加入多对引物同时对多个目的基因进行扩增，可在一次PCR反应过程中检测到多个致病原。秦毅斌等[54]根据Gen－Bank中PEDV变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株的S基因和ORF3基因，设计合成2对特异性扩增引物，通过目的片段的数量和片段大小来判断PEDV的毒株类型，建立了检测不同PEDV毒株类型的双重RT-PCR鉴别检测方法，该方法中PEDV变异毒株能同时扩增出234 bp和826 bp的2条目的条带，PEDV经典毒株只能扩增出1条234 bp的目的条带，弱毒疫苗株只能扩增出1条185 bp的目的条带，该方法检测A群猪轮状病毒（PRoVA）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）、伪狂犬病病毒（PRV）、猪嵴病毒（PKV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪细环病毒（TTV）均为阴性，能检测到的最低核酸浓度为2.3×10-4ng/μL，该方法检测91份临床腹泻样品，变异毒株阳性感染率为62.64%（57/91），经典毒株阳性感染率为3.30%（3/91），弱毒疫苗株阳性率为4.40%（4/91）。该多重RT-PCR鉴别检测方法能特异性区分PEDV变异毒株、经典毒株和弱毒疫苗株，可用于PEDV经典株、变异株和疫苗株的临床快速鉴别检测和流行病学调查。施开创等[55]针对PEDV S和ORF3基因序列设计3对特异性引物，经过反应条件的优化，建立了能够同时检测并区分PEDV经典株、变异株、疫苗株的三重RT-PCR方法，该方法中能同时扩增429 bp和198 bp者为经典株，能同时扩增274 bp和198 bp者为变异株，能同时扩增429 bp和148 bp者为疫苗株。该方法利用3对特异性引物实现了在同一个扩增反应中鉴别检测PEDV 3种不同毒株的目标，为PEDV变异毒株的鉴别诊断与流行病学调查提供了可靠的技术手段。PCR方法具有操作简单、检测迅速、特异、灵敏等优点，特别适合具有一般试验条件的基层实验室使用，将具有广阔的开发与推广应用前景。

4.2 血清学方法

PEDV变异毒株、经典毒株、疫苗株之间存在高度序列同源性和血清学交叉反应性，因而难以用普通的血清学方法将PEDV变异毒株区分开。单克隆体抗体具有高度的特异性和敏感性，能够识别病毒抗原结构的微小差异，因此，获得PEDV变异毒株的特异性单克隆体抗体成为建立区分PEDV变异毒株血清学诊断方法的关键。雷喜梅等[56]以纯化的PEDV变异株（CH/ZMDZY/11）S蛋白N端高变区（22-380 aa）重组蛋白为抗原免疫BALB/C小鼠，以纯化CH/ ZMDZY/11全病毒及带His标签的重组蛋白分别为筛选抗原，利用淋巴瘤杂交技术获得了一株稳定分泌抗S蛋白特异性单克隆抗体细胞株，该单克隆抗体诱生小鼠产生的腹水抗体效价为1∶3 200，免疫球蛋白类型为IgM。ELISA检测该单克隆抗体与PEDV变异毒株与疫苗株的反应显著差异，可区分变异毒株和疫苗毒株，有望成为PEDV变异株抗原检测的特异性抗体。李加飞等[57]将含有PEDV变异株S1基因的1个抗原表位（83-276 aa）的重组蛋白免疫BALB/C小鼠，成功制备了2株能够产生抗PEDV S蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别命名为1E5和5B7。间接免疫荧光试验表明，5B7单克隆抗体可以识别天然状态下的PEDV颗粒，与变异株和经典毒株均发生反应，而1E5单克隆抗体只与变异株发生特异性反应，与经典毒株不反应。表明所制备的抗PEDV S蛋白的1E5单克隆抗体能够有效检测和区分PEDV变异株和经典毒株，且对病原检测具有较强的特异性，为研制基于单克隆抗体的PEDV变异毒株血清学鉴别诊断方法奠定了物质基础。

5 结语

2010 年以来，我国PED流行现状分析表明，PEDV变异毒株目前是我国PEDV流行的优势毒株，且其区域性流行特点显著，部分地区感染率较高，感染情况比较严峻，变异毒株在我国猪群中的流行已不容忽视，应加强重视。针对PEDV变异毒株鉴别诊断方法研究已经有了突破性进展，研究学者已陆续建立了能够鉴别诊断PEDV变异株的RT-PCR方法，以及研制了针对PEDV变异毒株的单克隆抗体，这都将大幅有助于我国对PEDV变异毒株的鉴别诊断和有效防控。但RT-PCR方法敏感性有限，且扩增后电泳检测需要使用溴化乙锭（EB），对试验人员身体健康和生态环境均造成潜在威胁；具有高度特异性、能够区分PEDV变异毒株的单克隆抗体只是建立PEDV变异毒株血清学鉴别检测方法的物质基础，故对于PEDV变异毒株的鉴别检测方法仍需进一步完善。相信随着PEDV变异毒株病原学和致病机制研究的不断深入，高敏感性、高特异性PEDV变异毒株单克隆抗体的不断获得，以及分子生物学技术和免疫学技术尤其是荧光定量PCR技术和ELISA技术在PEDV检测中的不断开发应用，PEDV变异毒株荧光定量RT-PCR鉴别检测方法和ELISA鉴别检测方法将会陆续问世，进而为PEDV变异毒株的鉴别检测提供敏感性更高、特异性更强、全封闭反应、定量准确、不需要电泳的新型分子生物学检测技术和操作简单、检测快速、敏感、特异、高通量的血清学检测技术，实现PEDV变异毒株的准确、快速、鉴别诊断，逐步实现PEDV变异毒株区域净化，并最终达到全国净化的目标。

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（编辑：郭玉翠）

S858.285.3

A

1002-1957(2017)04-0117-04

2017-06-29

山东省自然科学基金资助项目（ZR2016CM35）；山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目（SDAIT-08-17）作者简介：祖立闯（1981-），男，黑龙江宾县人，助理研究员，硕士，主要从事动物疫病诊断技术研究工作.E-mail：zulichuang2008@126.com