PEG1000/ (NH4)2SO4双水相萃取磨盘柿叶总黄酮的研究

罗晓（龙口出入境检验检疫局，山东烟台264000）

PEG1000/ (NH4)2SO4双水相萃取磨盘柿叶总黄酮的研究

罗晓
（龙口出入境检验检疫局，山东烟台264000）

采用PEG1000/（NH4）2SO4双水相体系萃取柿叶分离总黄酮，考察了PEG1000、（NH4）2SO4和MgCl2用量、离心时间、pH值等因素对萃取率的影响。结果表明最佳萃取条件为：PEG1000（0.55g·mL-1），（NH4）2SO4（0.6g·mL-1），MgCl2（0.04g·mL-1），pH值为7，离心时间3min。萃取率可达94%。磨盘柿叶黄酮对DPPH自由基、超氧自由基、羟基自由基均有一定的清除作用。

双水相；柿叶；黄酮；萃取

柿子在我国各地普遍栽培，京津唐地区以磨盘柿闻名。磨盘柿以个大，形似“磨盘”而得名。柿蒂，柿霜，柿叶均可入药，《本草再新》中记载柿叶“味苦、性寒、无毒”，“专入肺经”。柿叶中含有单宁、胆碱、蛋白质、矿物质、糖、黄酮等活性物质，特别是Vc含量远高于常见的水果和蔬菜。柿叶煎服或代茶饮，有促进新陈代谢、降压、预防动脉硬化及镇咳化痰作用，此外，柿叶还有祛斑的功效。

黄酮类化合物是柿叶中的主要活性物质，具有抗癌、抗菌、抗氧化、降压、降脂等功能，在医学上可用于治疗冠心病、脑血栓、消除自由基。

双水相萃取技术是一种液-液萃取分离技术，广泛用于生物活性物质的提取和分离[1，2]，文中采用PEG1000/（NH4）2SO4双水相法对磨盘柿叶黄酮进行萃取分离，并对其抗氧化作用进行了研究，为磨盘柿叶黄酮的提取分离奠定基础。

1 实验部分

1.1 材料

磨盘柿叶（采集于河北遵化，干燥、粉碎，过40目筛备用）。

1.2 仪器及试剂

752紫外-可见分光光度计（杭州）；HH-8恒温数显水浴锅（江苏）；BS124S电子天平（北京）；DELTA 320酸度计（成都）；800型离心机（江苏）

NaOH、HCl、Al（NO3）3、NaNO2、无水乙醇、PEG1000、（NH4）2SO4、DPPH、邻苯三酚、H2O2，以上均为分析纯。芦丁（标准品，含量≥95%）、

1.3 实验方法

1.3.1 绘制芦丁标准曲线采用NaNO2-A（l NO3）3-NaOH显色法[1]，在510nm下测定吸光度，绘制芦丁标准曲线，据此可以计算溶液中黄酮含量。

1.3.2 磨盘柿叶总黄酮的提取选用L（934）正交表

1.3.3 双水相萃取柿叶中总黄酮吸取3.0mL的柿叶黄酮粗提液于10mL离心管中，依次加入4.0mL PEG1000溶液和4.0mL（NH4）2SO4溶液，调节pH值，在2000r·min-1的转速下离心3min，以加速相分离过程。用注射器吸取上下相溶液进行分析，分别测定上、下相体积；按标准曲线法显色后于510nm处测定其吸光度，得出双水相中上、下相中柿叶黄酮的含量，计算萃取率：

式中V1、V2：分别是上、下相体积；c1、c2：分别是上、下相中黄酮的浓度。

并通过单因素试验分别考查PEG1000、（NH）42SO4、MgCl2用量及离心时间和pH值等对磨盘柿叶中总黄酮萃取率的影响。

1.3.4 磨盘柿叶黄酮的抗自由基能力的测定

1.3.4.1 柿叶黄酮对DPPH自由基的清除作用分别取1%磨盘柿叶黄酮溶液和1%Vc溶液1.0mL，置于10mL比色管中，加入3.0mL 0.04mg·mL-1的DPPH乙醇溶液，室温避光反应30min，同时以无水乙醇为空白，于517nm处测定吸光值，按下式计算：

式中A0：1.0mL蒸馏水+3.0mLDPPH溶液的吸光度值；As：1.0mL样品溶液+3.0mLDPPH溶液的吸光度值；Ac：1.0mL样品溶液+3.0mL无水乙醇的吸光度值。

1.3.4.2 柿叶黄酮对羟基自由基的清除作用取3支10mL比色管分别加入7.5mmol·L-1邻二氮杂菲溶液0.2mL，加入7.5mmol·L-1硫酸亚铁铵溶液0.2mL，加入pH≈7.4磷酸盐缓冲溶液1mL，在2，3号比色管加入7.5mmol·L-1H2O21.0mL，在3号比色管中再加入1.0mL柿叶黄酮溶液，用去离子水定容至刻度，在37℃水浴中反应1h，冷水冷却，以水为参比，在508nm处测其吸光度值，按下式计算：

式中A1：不加双氧水和黄酮的吸光度值；A2：只加H2O2的吸光度值；A3H2O2和黄酮均加的吸光度值。1.3.4.3柿叶黄酮对超氧自由基的清除作用取3mL pH值接近8.0的磷酸盐缓冲溶液于10mL比色管中，置于25℃水浴中预热20min，分别加入同体积不同浓度的待测液溶液和0.6mL 30mmol·L-1的邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中预热5min，加入0.5mL 1mol·LHCl终止反应，于420nm处测定吸光度值A1。以同体积的去离子水代替样品，吸光度记为A0，作空白对照。考虑到待测液本身可能在420nm处有吸收，用同体积的去离子水代替邻苯三酚溶液，得A2，按下式计算：

2 结果与讨论

2.1 标准曲线

以芦丁为标准品，采用NaNO2-A（l NO）33-NaOH显色法，在510nm下测定吸光度，绘制标准曲线如图1。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Rutin standard curve

由最小二乘法得出标准曲线的回归方程为：

A=0.0114c-0.0018，浓度在0～60μg·mL-1范围内线性良好，相关系数r=0.9998，据此式可求溶液中黄酮含量。

2.2 正交实验结果

乙醇为溶剂提取磨盘柿叶总黄酮，正交试验结果见表1。

表1 L9（34）正交实验结果Tab.1 L9（34）orthogonal experimental results

最优组合为A3B1C2D2，即柿叶中黄酮的最佳提取工艺为：70%乙醇，回流时间1h，提取温度80℃，固液比为1∶15。影响因素的主次顺序为回流温度＞回流时间＞乙醇浓度＞固液比。

2.3 双水相萃取柿叶中黄酮

2.3.1 PEG1000用量对黄酮萃取率的影响根据1.3.3的方法，固定其他条件不变，改变PEG1000的用量，计算黄酮萃取率。结果见图2。

图2 PEG1000用量对萃取率的影响Fig.2 Effectof PEG1000 contenton extraction rate

由图2可知，当PEG1000的用量为（0.55g·mL-1）时，柿叶中黄酮的萃取率可达到90%，所以确定PEG1000的最佳用量比为（0.55g·mL-1）。

2.3.2 （NH4）2SO4用量对黄酮萃取率的影响固定其他萃取条件不变，只改变硫酸铵用量，计算黄酮萃取率，结果见图3。

图3 硫酸铵用量对萃取率的影响Fig.3 Effectof ammonium sulfate dosage on extraction rate

由图3可知，随着硫酸铵用量的增加，黄酮萃取率先升高，然后下降，当硫酸铵用量比为（0.6g·mL-1）时，黄酮的萃取率最高达到90%。故确定硫酸铵的用量为（0.6g·mL-1）。

2.3.3 离心时间对黄酮萃取率的影响固定其他萃取条件不变，改变离心时间，计算黄酮萃取率，结果见图4。

图4 离心时间对黄酮萃取率的影响Fig.4 Effectof centrifugation time on extraction rate of flavonoids

由图4可见，当离心时间为3min时，黄酮萃取率达到90%，3～5min内趋于稳定，故选择离心时间为3min。

2.3.4 MgCl2对黄酮萃取率的影响固定其他萃取条件不变，改变MgCl2的添加量，计算黄酮萃取率，结果见图5。

图5 MgCl2用量对黄酮萃取率的影响Fig.5 EffectofMgCl2content on the extraction rate of flavonoids

加入MgCl2有助于缩短分相时间，提高相分离速度，由图5可见MgCl2的用量比为（0.04g·mL-1）时，黄酮的萃取率最大。所以选择MgCl2的添加量为（0.04g·mL-1）。MgCl2起到盐析作用，增加水溶性，使水溶性蛋白质物质析出到下相中。

2.3.5 pH值对黄酮萃取率的影响图6考察了不同pH时对磨盘柿叶中黄酮的萃取率的影响。

图6 pH值对黄酮萃取率的影响Fig.6 Effectof pH on extraction rate of flavonoids

pH值的变化改变了磨盘柿叶黄酮的电性和表面性质，同时也改变了无机离子的分配情况，从而影响两相之间的电位差。从图6中可以看出，pH值为7～8时，黄酮萃取率最高，并趋于平稳。实验中发现当pH＞8时，溶液开始变浑浊，且随着pH值继续增大，溶液不分相。

2.3.6 验证实验结果根据以上单因素实验确定，分离纯化磨盘柿叶中黄酮的最佳双水相体系是：3mL粗提液，加4mLPEG1000（0.55g·mL-1），4mL硫酸铵（0.6g·mL-1），1mLMgCl2（0.04g·mL-1），pH值为7，离心时间3min。在此条件下进行验证试验，结果见表2。

表2 验证实验Tab.2 Verification experiment

可见，在最佳条件下，萃取率可达94.37%。

2.3.7 磨盘柿叶黄酮抗自由基实验结果磨盘柿叶黄酮抗自由基实验结果见表3。

表3 对自由基的清除实验结果Tab.3 Results of scavenging free radical

通过对比，结果表明磨盘柿叶黄酮具有较高的清除DPPH自由基和超氧自由基能力，清除率均超过75%，其中对DPPH自由基清除效果与Vc相当，略高于Vc；而对超氧自由基清除率比Vc高15%。而磨盘柿叶黄酮溶液对羟自由基的清除能力明显低于Vc溶液，只有56%，比Vc低了20%。

3 结论

（1）运用乙醇提取法对磨盘柿叶中的黄酮进行提取，通过正交实验，确定了最佳提取工艺条件：乙醇浓度为70%，回流时间为1h，提取温度为70℃，固液比为1∶10。影响因素的大小顺序为：回流温度＞回流时间＞乙醇浓度＞固液比。

（2）采用双水相萃取技术对磨盘柿叶中黄酮进行分离，得到了最佳萃取条件：3mL粗提液，加入4mL（0.55g·mL-1）PEG1000，4mL（0.6g·mL-1）硫酸铵，1mL（0.04g·mL-1）MgCl2，pH值为7，离心时间3min。在此条件下黄酮的萃取率可达94%以上。

（3）抗自由基实验结果表明磨盘柿叶黄酮对DPPH自由基、超氧自由基的清除率均高于Vc，可达75%以上；但对羟基自由基的清除率只有56%，明显低于Vc。

实验结果表明，PEG1000/(NH4)2SO4双水相体系适合于磨盘柿叶黄酮的萃取分离，成本低且不易引起生物活性物质变性或失活。

［1］郭辉,张中玉,罗宇倩,等.双水相萃取法分离竹叶黄酮的工艺研究［J］.2012,34（2）:24-28.

［2］董树国,赖红伟,陆钊.双水相萃取在黄酮类化合物分离分析中的应用［J］.广州化工,2009,37（7）:43-44.

［3］尉芹，王冬梅，马希汉,等.杜仲黄酮含量测定方法研究［J］.西北农林科技大学（白然科学版），2001,29（5）:199-122.

［4］陆强,邓修.提取与分离天然产物中有效成分的新方法-双水相萃取技术［J］.中成药，2000,22（9）:22-23.

Study on extraction of total flavonoids from persimmon leaves by PEG1000/（NH4）2SO4aqueous two-phase extraction technique

LUO Xiao
（longkou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Yantai264000,China）

Using PEG1000/（NH4）2SO4aqueous two-phase extraction technique to separate the total flavonoids extracted from Persimmon leaves.Effect of the dosages of PEG1000,（NH4）2SO4and MgCl2,centrifugation time and pH on the extraction rate was studied.The results showed that the best extraction conditions were as followes: polyethylene glycol 1000（0.55g·mL-1）,ammonium sulphate（0.6g·mL-1）,MgCl2（0.04g·mL-1）,pH=7,centrifugation time was 3min.And the extraction rate reached 94%.The total flavonoids from mopan persimmon leaves had a certain scavenging effecton DPPH free radical,superoxide free radical,and hydroxyl radical.

persimmon;flavonoids;aqueous two-phase extraction

R284.2

A

2017-02-27

罗晓（1988-），女，助理工程师，2012年毕业于山东师范大学，化学工程与工艺专业，大学本科，主要从事食品化矿分析工作。进行正交试验法考察温度、时间、提取剂浓度、固液比等因素对提取磨盘柿叶总黄酮的影响，按最优条件提取磨盘柿叶总黄酮得粗提液。

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20170729