高产橙花叔醇的酵母细胞工厂创建

张丽丽 马晓琳 王冬 郁彭 黄璐琦 张学礼 戴住波

[摘要]橙花叔醇为萜类精油成分，具有抗菌、抗肿瘤和抗氧化等多种生物学活性。为了实现在酿酒酵母中异源生产橙花叔醇，该研究首先将猕猴桃Actinidia chinensis来源的橙花叔醇合酶（NES）基因通过密码子优化、人工合成后转入底盘菌株FPP001中获得工程菌株NES001，其橙花叔醇产量达到271 mg·L-1。在进一步工作中，橙花叔醇合酶的N端通过连接肽GGGS 融合法尼烯合酶（FPS）后得到橙花叔醇产量显著提高的工程菌NES002，其产量是NES001的5980倍，达到16207 mg·L-1。最终，通过恢复NES002中色氨酸生物合成缺陷基因TRP1得到工程菌NES003，该菌在高密度发酵体系中橙花叔醇产量能达到1 71153 mg·L-1。该研究为微生物发酵法生产橙花叔醇等倍半萜化合物提供了基础。

[关键词]精油；橙花叔醇；合成生物学；酿酒酵母

Construction of cell factories for high production of nerolidol

in Saccharomyces cerevisiae

ZHANG Lili1，2，3， MA Xiaolin1，2，3， WANG Dong2，3， YU Peng1， HUANG Luqi4， ZHANG Xueli2，3*， DAI Zhubo2，3*

（1 College of Biotechnology， Tianjin University of Science & Technology， Tianjin 300457， China；

2.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology， Chinese Academy of Sciences， Tianjin 300308， China；

3.Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology， Chinese Academy of Sciences， Tianjin 300308， China；

4 State Key Laboratory Breeding Base of Daodi Herbs， National Resource Center for Chinese Materia Medica，

China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract]Nerolidol is an important constituent of terpenoid essential oil and has excellent antitumor， antibacterial， and antioxidative properties For realizing heterogenous production of nerolidol， our research firstly integrated the codonoptimized Actinidia sinensis nerolidol synthase gene （NES） into the terpenoid chassis strain FPP001， and obtained NES001 that could produce 271 mg·L-1 nerolidol Then， the Nterminal of the NES was fused with FPS by linker peptide GGGS With this strategy， nerolidol production improved by 5980fold， reaching 16207 mg·L-1 Finally， by introduction of auxotrophic marker TRP1 in NES002， the resulting strain NES003 could produce 1 71153 mg·L-1 by high cell density fermentation method This study provides the basis for the fermentative production of nerolidol and other sesquiterpenoids

[Key words]essential oils； nerolidol； synthetic biology； Saccharomyces cerevisiae

橙花叔醇（nerolidol）是具有芳香性的倍半萜精油成分[1]，主要存在于中藥降香，陈皮等100多种香料植物中[2]。由于橙花叔醇特殊的香味，可用于配制玫瑰型、紫丁香型等多种花香型日化香精，被广泛应用于化妆品和洗涤领域；同时橙花叔醇具有抗疟疾[3]，抗肿瘤[4]，抗溃疡[5]，抗氧化[6]和抗菌[7]等多种生物活性，已被美国食品和药物管理局批准作为食品调味剂[8]。目前，橙花叔醇的传统获得方法是从植物精油中浓缩、浸取而得，由于该方法存在提取效率低、浪费植物资源、破坏生态环境等问题，不符合可持续发展的要求[9]。

近年来，利用合成生物学的原理，设计和改造微生物菌株来生产青蒿素，人参皂苷等中药有效成分已被认为是一种很有潜力的方法[1012]。酿酒酵母由于其遗传背景清晰、遗传改造技术和发酵方法成熟，已经被广泛应用到构建合成萜类化合物的底盘菌中。在酿酒酵母中，乙酰辅酶A在MVA途径7个酶的催化下，可生成所有萜类化合物合成的前体物质异戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）。在倍半萜化合物生物合成途径中，IPP和DMAPP可在法呢基焦磷酸合成酶（FPS）的作用下生成倍半萜类化合物的合成前体法呢烯基焦磷酸（FPP），FPP可在不同倍半萜合成酶的催化作用下生成橙花叔醇等各种倍半萜化合物，见图1。endprint

实验室前期，已构建了1株过表达MVA途径7个基因的底盘菌株NK2SQ，其可显著增加酿酒酵母内萜类化合物的合成通量[11]。在本研究中，底盘菌株NK2SQ中参与乙醇合成乙酰辅酶A的乙醇脱氢酶（ADH2）、乙醛脱氢酶（ALD6）和乙酰辅酶A合酶（ACS1）等酶基因的表达调控，猕猴桃Actinidia chinensis来源的橙花叔醇合酶（NES）基因（GenBank： JN2422431）密码子优化，NES与FPS酶蛋白融合，以及高密度发酵等策略进一步用于提高细胞工厂合成橙花叔醇的能力。相关结果为微生物发酵法生产橙花叔醇等倍半萜化合物奠定了基础。

1材料

11工具酶与试剂PrimeSTAR HS DNA聚合酶购自于大连宝生物工程公司；酵母基因组DNA提取试剂盒购自北京康为世纪有限公司；质粒小量快速提取试剂盒购自美国Axygen公司；氨苄青霉素、DNA清潔试剂盒与DNA回收试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母选择培养基购自北京泛基诺科技有限公司；麦角固醇、鲨烯和橙花叔醇标准品购自美国SigmaAldrich公司；其他试剂均为分析纯。

12质粒，菌株及引物本次研究所用的质粒，菌株及引物信息见表1，2。

HMGCoA 3hydroxy3methylglutaryl coenzyme A； IPP isopentenyldiphosphate； DMAPP dimethylallyldiphosphate； FPPfarnesyl pyrophosphate； ERG10 acetoacetylCoA thiolase； ERG13 HMGCoA synthase； HMG1 HMGCoA reductase； ERG12 mevalonate kinase； ERG8 phosphomevalonate kinase； ERG19 mevalonate pyrophosphate decarboxylase； IDI1 isopentenyl diphosphate isomerase 1； ERG20 FPP synthase； ADH2alcohol dehydrogenase； ALD6 acetaldehyde dehydrogenase； ACS1 acetylCoA synthetase； NES nerolidol synthase。

13培养基LB培养基：1% 蛋白胨，05% 酵母粉，1% 氯化钠，100 mg·L-1氨苄青霉素；SMUra筛选培养基：08% 酵母选择培养基（三缺，UraTrpHis），2%葡萄糖，001% Trp，0005% His；SMUraHis筛选培养基：08% 酵母选择培养基（三缺，UraTrpHis），2% 葡萄糖，001%Trp；SMUraHisLeu筛选培养基：08% 酵母选择培养基（四缺，UraTrpHisLeu），2% 葡萄糖，001% Trp。SMUraHisLeuTrp筛选培养基：08% 酵母选择培养基（四缺，UraTrpHisLeu），2% 葡萄糖。上述液体培养基加2% 的Agar可配成相应的固体培养基。

高密度发酵培养基和补料培养基参照人参皂苷高密度发酵培养基配方配制[12]。

2方法

21FPP001菌株的构建构建FPP001工程菌株所采用的方法为多片段同源重组。首先，模板和引物的搭配方案见图2和表3，用PrimeSTAR HS高保真聚合酶扩增和割胶回收得到用于同源重组的各

个片段。用SMUra培养基活化NK2SQ后将各个片段转入醋酸锂方法制备的感受态中，并用SMUraHis固体培养基筛选转化子。转化子再分别用SacⅡPGK1/ADH2Asc1，PacpTDH3/ACS1Asc1，SacⅡpTEF1/ALD6Asc1等 3对引物进行PCR验证和测序验证后，得到工程菌FPP001。

22NES系列菌株的构建用醋酸锂的方法制备FPP001感受态细胞，将质粒pRS313NES转入FPP001感受态细胞，并用SMUraHisLeu固体培养基筛选转化子。转化子再用SacIIpTEF1/NESAsc1引物进行PCR验证和测序验证后，得到工程菌NES001。

用醋酸锂的方法制备FPP001感受态细胞，将质粒PRS313FPSGGGSNES转入FPP001感受态细胞，并用SMUraHisLeu固体培养基筛选转化子。转化子再用SacIIpTEF1/NESAsc1引物进行PCR验证和测序，得到工程菌NES002。

以ZDTRP1intergup/ZDTRP1intergdown为引物，BY4742基因组为模板，使用 PrimeSTAR HS高保真聚合酶扩增和割胶回收得到用于同源重组的片段TRP1。用醋酸锂的方法制备NES002感受态细胞，将片段TRP1转入NES002感受态细胞，并用SMUraHisLeuTrp固体培养基筛选转化子。直接将转化子进行测序，得到工程菌NES003。

23发酵及产物提取摇瓶发酵：挑取平板上的单克隆于相应液体培养基中，30 ℃，250 r·min-1过夜制备种子液。将种子液接种以1%的接种量接种于含15 mL相应液体选择培养基的100 mL三角瓶中，30 ℃，250 r·min-1振荡培养1 d，然后加入15 mL正十二烷，继续震荡培养6 d。最后，将三角瓶中液体转移至50 mL离心管，5 000 r·min-1离心5 min，收集有机相，用正己烷稀释10倍，过有机尼龙膜（022 μm）后备用。

高密度发酵：经火焰接种环，将300 mL种子液加入含3 L发酵培养基的7 L发酵罐中。发酵过程中参数设定值分别为：温度30 ℃，pH 50，溶氧30%，空气流量3～20 L·min-1，搅拌转速300～1 000 r·min-1，溶氧与搅拌转速、通气相偶联。补料策略为：溶氧值大于60%时，向发酵罐中加入补料培养基至发酵液中葡萄糖浓度为10 g·L-1。尾气管通入含有300 mL正十二烷的吸收瓶，发酵112 h后向发酵罐中加入200 mL正十二烷，500 r·min-1搅拌1 h，收集有机相，用正己烷稀释100倍，过有机尼龙膜（022 μm）后备用。endprint

24橙花叔醇、麦角固醇及鲨烯的检测正己烷配制橙花叔醇，麦角固醇和鲨烯对照品溶液，使用GCMS进行样品的定性和定量分析[12]。橙花叔醇GCMS测定条件：进样口温度250 ℃，进样体积1 μL，不分流，溶剂延时3 min；色谱柱：HP5ms （025 mm×30 m）；色谱条件：45 ℃，1 min，10 ℃·min-1到300 ℃保温5 min；MS条件：Full Scan： 50～750 amu。麦角固醇和鲨烯GCMS测定条件：进样口温度300 ℃，进样体积1 μL，不分流，溶剂延时12 min；色谱柱：HP5 ms（025 mm×30 m）；色谱条件：80 ℃，1 min；20 ℃·min-1到300 ℃保温18 min；MS条件：SIM69，109，135，363，411。

3结果与分析

31橙花叔醇酿酒酵母细胞工厂创建及产物鉴定橙花叔醇合成酶基因（NES）能以酿酒酵母中生成的FPP为底物合成目标产物橙花叔醇，见图1。实验室前期，已构建了1株过表达MVA途径7个基因的底盘菌株NK2SQ，其可显著增加酿酒酵母内萜类化合物的合成通量[11]。为了进一步强化底盘菌的性能，底盘菌株NK2SQ中参与乙醇合成乙酰辅酶A的乙醇脱氢酶（ADH2）、乙醛脱氢酶（ALD6）和乙酰辅酶A合酶（ACS1）等3个酶基因被过表达：PCR克隆得到的ADH2，ACS1，ALD6基因分别与相应的强启动子PGK1，TDH3，TEF1和终止子连接后，利用同源重组一次整合到NK2SQ基因组的NDT80位点，见图2。转化子经过缺陷培养基的筛选、PCR和测序验证后得到倍半萜类化合物底盘菌FPP001，PCR验证结果见图3A。

AFPP001 PCR验证图；BNES001 PCR验证图；CNES002 PCR验证图；MTrans 2K plus marker；A图中泳道1～3分别是3个基因及相应的启动子的PCR验证图，泳道4～6为对照菌PCR验证图； B图中泳道1～2分别是NES001和对照菌PCR验证图；C图中泳道1～2分别是NES002和对照菌PCR验证图。

在此基础上，将人工合成的NES基因置于强启动子TEF1下获得质粒pRS313NES，再将pRS313NES转入到酿酒酵母底盘菌FPP001中，转化子经缺陷培养基的筛选，PCR与测序验证后得到工程菌NES001，见图3B。底盘菌FPP001和工程菌NES001在缺陷培养基中发酵6 d后，利用GCMS对发酵产物进行定性和定量分析，发现工程菌株NES001能在1460 min出现与反式橙花叔醇对照品相同质谱图的新峰见图4，其产量为271 mg·L-1，见图5。

A Nerolidol 代表橙花叔醇对照品，FPP001代表工程菌FPP001发酵产物，NES001代表工程菌NES001发酵产物； B反式橙花叔醇标准品质谱图； C工程菌NES001发酵产物中橙花叔醇质谱图。

32蛋白质融合方法优化橙花叔醇酿酒酵母细胞工厂生物合成途径上各个酶的空间靠近对中间产物的流向有着非常重要的影响。拉近合成途径中的2个（或多个）功能相关的酶的空间距离，从而在空间上更有利于2个催化反应的进行，能有效提高产物的产量。因此，利用连接肽将功能相关的酶进行融合，已经成为蛋白质工程优化重要策略[13]。在橙花叔醇的生物合成途径中，法呢基焦磷酸合成酶（FPS）能催化IPP和DMAPP合成NES酶的底物法呢基焦磷酸（FPP）。为进一步提高橙花叔醇的产量，利用连接肽GGGS将FPS融合到NES酶的N端，转入底盘菌FPP001得到橙花叔醇产量显著提高的工程菌NES002，其产量是初始菌株NES001的5980倍，达到16207 mg·L-1。

工程菌营养缺陷基因的恢复能提高菌株的发酵性能。在NES002菌株的基礎上，恢复了其缺陷基因TRP1，转化子经缺陷培养基筛选和测序验证后得到工程菌NES003。 NES003在缺陷培养基中发酵6 d后，其橙花叔醇产量达到19560 mg·L-1，见图5。较菌株NES002产量提高了2069%。

33NES003高密度发酵进一步提高橙花叔醇产量酵母菌的高密度发酵既可提高产物的生产率，又能充分利用生物反应器的容积和降低分离成本[12，1415]。本研究中，利用实验室前期建立的萜类发酵工艺对高产菌NES003进行高密度发酵。工程菌NES003发酵72 h后，细胞生长进入平台期，112 h时菌的生长A600能达到22517，此时橙花叔醇的产量达1 71154 mg·L-1，与摇瓶发酵相比，提高了775倍，见图6。其中，发酵尾气中橙花叔醇的含量约占总量的210%，发酵罐和尾气瓶中分别为1 67633，3521 mg·L-1，发酵产物存在一定挥发性。另外鲨烯和麦角固醇等竞争性分支途径的代谢物分别为9410，31564 mg·L-1。

4讨论

近年来，蛋白质融合技术已经发展成为一种有效提高目标化合物产量的手段，例如：ZHOU等把SmCPS，SmKSL进行融合，以及BTS1（GGPP合酶），ERG20（FPP合成酶）的融合等方法应用于次丹参酮二烯工程菌的构建，酿酒酵母工程菌次丹参酮二烯的产量达到了365 mg·L-1[16]。ZHAO等通过构建Erg20p（F96WN127W）tVoGES融合酶，并对中间连接肽和酶顺序进行优化，运用其他代谢手段，酿酒

酵母工程菌香叶醇产量达到662 mg·L-1，产量比原来报道的最高香叶醇产量高出了7倍多[17]。本研究将功能相关的NES和FPS进行融合，将橙花叔醇的产量提高了5980倍，为利用融合蛋白技术提高目标化合物产量提供了强有力的支持。

在发酵过程中，TRP1营养缺陷型筛选标记的缺失会对酿酒酵母的生长表型产生影响，例如使用TRP1功能缺陷的NES002进行高密度发酵时，虽然我们在培养基中添加了适量的色氨酸作为补充，但其细胞生物量指标A600未超过3000，然而当利用NES003进行发酵时其菌株A600显著提高超过7倍，可以达到22517。另外，工程菌株中竞争性分支途径的代谢物鲨烯的含量一直维持在很低水平，提示代谢流主要流向橙花叔醇合成方向，下一步改造将围绕提高萜类化合物整体代谢流展开。endprint

橙花叔醇是具有怡人香味的萜类精油化合物，在化妆品和食品领域有广泛应用，目前全球需求范围在10～100 t[18]。利用合成生物学原理，创建人工酵母细胞生产橙花叔醇可为橙花叔醇的制备提供新的来源。本研究通过底盘菌株优化，外源橙花叔醇合酶的转入，蛋白质融合以及高密度发酵等策略，最终获得可生产1 71153 mg·L-1橙花叔醇的酵母细胞工厂NES003。本研究为微生物发酵法生产橙花叔醇等倍半萜化合物提供了基础。

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[責任编辑吕冬梅]endprint