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不同施肥处理对党参产量和次生代谢物含量的影响研究

2017-08-30胡佳栋毛歌张志伟马存德梁宗锁夏广东董娟娥

中国中药杂志 2017年15期
关键词:采收期施肥党参

胡佳栋 毛歌 张志伟 马存德 梁宗锁+夏广东 董娟娥

[摘要]采用单因素随机区组实验设计,研究不同施肥处理对党参产量和次生代谢物合成积累量的影响,确定合理的施肥配比和采收期,为党参规范化栽培提供依据。试验结果显示,适量氮肥有利于党参根直径和根生物量的提高,磷肥可以促进党参多糖含量的增加,有机肥可以提高党参炔苷的含量。党参产量、多糖及醇溶性浸出物含量随着生长时间的延长而增加,党参炔苷含量随着生长时间的延长而减少。综合各因素分析,试验区党参的合理采收期应为10月下旬,施用有机肥对党参生物量和次生代谢物的积累最有利。

[关键词]党参; 施肥; 产量; 党参炔苷; 党参多糖; 采收期

Effect of different fertilization treatments on yield and

secondary metabolites of Codonopsis pilosula

HU Jiadong1, MAO Ge1, ZHANG Zhiwei2, MA Cunde2, LIANG Zongsuo3, XIA Guangdong4, DONG Juane1*

(1 College of Life Sciences, Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling 712100, China;

2 Shanxi BuChang Pharma Co, Ltd, Xi′an 710000, China;

3 Zhejiang SciTech University, Hangzhou 310000, China;

4Border Defence Academy of PLA, Xi′an 710108, China)

[Abstract]The research studies the effect of different fertilization treatments on yield and accumulation of secondary metabolites of Codonopsis pilosula by using single factor randomized block design, in order to ensure reasonable harvesting time and fertilization ratio, and provide the basis for standardized cultivation of C pilosula According to the clustering results, the nitrogen fertilizer benefitted for the improvement of root diameter and biomass of C pilosula The phosphate fertilizer could promote the content of C pilosula polysaccharide The organic fertilizers could increase the content of lobetyolin With the time going on, C pilosula′s yield, polysaccharide and ehanolsoluble extracts increased while the content of lobetyolin decreased According to various factors, October is a more reasonable harvest period Organic fertilizers are more helpful to the yield and accumulation of secondary metabolites of C pilosula

[Key words]Codonopsis pilosula; fertilization; yield; lobetyolin; polysaccharide; harvest time

党参为桔梗科植物党参Codonopsis pilosula (Franch) Nannf、素花党参C. pilosula Nannf var modesta (Nannf) L T Shen或川党参C tangshen Oliv的干燥根。性味甘、平归脾、肺经,具有补中益气、健脾益肺的功效[1]。目前,党参在中国主要分布于西北、东北和华北部分地区,其中,甘肃省党参的种植面积最大,产量居全国之首[2]。合理施肥是增加植物种植产量的主要途径之一,而合理施肥配比和施肥量能显著提高党参的产量和品质[23]。目前,关于党参施肥的研究主要集中于氮肥、磷肥以及微量元素肥料[24],但是对于有机肥和中草药专用肥的施用研究相对较少。同时,在甘肃党参主产区,采收期主要是根据种植区药农的经验沿袭下来,一般在9月下旬至10月上旬[37]。但是,随着中药材栽培技术的规范化和科学化、以及当地气候条件的不断变化,传统的栽培技术和采收时间就显现出了其不科学性。如何能够在现有土地资源的基础上提质增效、提高土地利用率是目前农业部强化7大重点区域环境治理、推动农业绿色发展的重点任务。

本研究通过对不同施肥条件下不同采收期的党参的质量指标进行测定,并结合统计学的方法进行分析,旨在明确不同施肥条件对党参产量及有效成分含量的影响,确定相对合理的采收期,提出试验区所代表的土壤肥力状况下党参生长适宜的施肥方案,为党参规范化栽培提供技术支持。

1材料與方法

11试验区概况

本试验于在2016年3—11月在陕西步长制药有限公司的甘肃宕昌GAP基地进行,试验区海拔2 400 m,年均日照1 9865 h,年均降水量450 mm,年均气温10 ℃,年均无霜期180 d,最大冻土深度45 cm。0~20 cm耕层土壤的基本情况:pH 796,有机质2958 g·kg-1、全氮1547 g·kg-1、碱解氮7561 mg·kg-1、全磷0469 5 g·kg-1、速效磷2385 mg·kg-1、全钾296 g·kg-1、速效钾35770 mg·kg-1。前茬作物为马铃薯。endprint

12样品

供试党参为陕西步长制药有限公司甘肃宕昌GAP基地主栽品种。供试肥料:尿素(含氮46%)、过磷酸钙(含磷按P2O5计为14%)、磷酸二胺(含氮18%,含磷按P2O5计为46%)、有机肥为完全腐熟的牛粪(含045%氮,025% P2O5,015% K2O,有机质145%)、中草药专用肥(由西北農林科技大学提供;总养分≥48%,有机质≥45%,活化腐殖酸≥2%,氮磷钾≥5%;有益菌≥02亿个/g,富含16种微量元素)。

13仪器及试剂

Waters1525 系列 HPLC 系统,DAD 检测器,Sunfire C18色谱柱(46 mm×250 mm,5 μm),C18保护柱(46 mm×20 mm,5 μm),Empower Ⅱ色谱工作站(美国 Waters 公司);超声波清洗机(浙江宁波超声波仪器公司);超纯水仪(上海优普超纯水公司);UV1800紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司);DKS26电热恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司);HC3018R高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司);电热鼓风干燥箱(上海实验仪器有限公司);高速万能粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司);RE52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

无水乙醇(成都市科龙化工试剂厂);浓硫酸(西陇化工有限公司);葡萄糖、蒽酮、3,5二硝基水杨酸(国药集团化学试剂有限公司);丙三醇(广州光华科技股份有限公司);色谱级甲醇和乙腈(美国 Fisher 公司);党参炔苷购于上海中药标准化研究中心;本实验所用试剂均为分析纯。

14试验设置

采用单因素随机区组设计进行施肥试验(表1)。以施中草药专用肥和不施肥作为对照,3次重复,共计42个小区。各试验小区为4 m×55 m。党参栽植株行距为10 cm×20 cm,栽植深度10~15 cm,移栽密度为5025万株/hm2。各小区除播种前施肥外,生育期间不施肥。各处理田间除草、病虫害、及水分管理措施一致。

15指标测定

151农艺性状指标和产量的测定

分别于2016年8月30日、9月30日、10月20日采样,每个小区随机采集3个样点,每样点采集10株党参,洗净泥土,用钢卷尺测定根长,游标卡尺测定根直径,用天平测定单根鲜重,然后放于105 ℃烘箱中杀青30 min 后置阴凉通风处晾干,含水量达16%以下时测其单根干重[1],再根据种植密度换算出产量(kg·hm-2),并将晾干后的药材粉碎,过80目筛,备用。

152醇溶性浸出物测定

依据《中国药典》2015年版通则2201“浸出物测定法”操作进行[1]。

153党参多糖的提取和含量测定

称取党参粉末05 g,加入10 mL的蒸馏水。超声处理30 min,提取2次,7 000 r·min-1离心10 min,合并上清液,定容至50 mL,4 ℃储存备用。采用蒽酮浓硫酸法联合3,5二硝基水杨酸(DNS)法测定党参多糖含量。蒽酮浓硫酸法检测溶液中总糖的质量浓度,DNS法检测溶液中还原糖的质量浓度[8]。

1531标准曲线的绘制蒽酮浓硫酸法:称取干燥至恒重的葡萄糖标准品1000 0 g,蒸馏水定容至100 mL,配置成质量浓度为10 g·L-1标准储备液,精密吸取标准储备液1 mL,蒸馏水定容至100 mL,配置成质量浓度为01 g·L-1的葡萄糖对照品溶液。分别吸取标准溶液0,04,05,06,07,08,10 mL于5 mL比色管中,编号1~7,各加入40 mL 02%蒽酮浓硫酸试剂,摇匀冷却后与沸水浴中加热5 min,冷却后用浓硫酸定容到5 mL,静置10 min,以1号为空白,于波长620 nm处测其吸光度,以吸光度为横坐标,葡萄糖标品质量浓度(mg·L-1)为纵坐标绘制标准曲线,回归方程为Y=26433X-0081 9,R2=0999 4,在801~2002 mg·L-1有较好的线性关系。

DNS法:精密称取干燥至恒重的葡萄糖对照品100 mg,蒸馏水定容至100 mL,配置成质量浓度为10 g·L-1的对照品溶液。吸取对照品溶液0,02,04,06,10,14,18,20 mL于10 mL比色管中,分别补加蒸馏水至2 mL,分别添加15 mL DNS试剂,混匀后沸水浴5 min,冷却后定容至10 mL,静置20 min,编号1~8,以1号为空白,于波长540 nm处测其吸光度,以吸光度为横坐标,葡萄糖对照品质量浓度(mg·L-1)为纵坐标绘制标准曲线,回归方程为 Y=1024X+1508,R2=0999 6,在2001~9002 mg·L-1有较好的线性关系。

1532样品总糖、还原糖质量浓度的测定分别取05 mL稀释50倍的提取液用蒽酮-浓硫酸法测定总糖质量浓度,分别取04 mL用DNS法测还原糖质量浓度,多糖质量浓度(g·L-1)=总糖质量浓度-还原糖质量浓度。

154党参炔苷的提取和含量测定

采用高效液相色谱法[9]。色谱条件:Agilent C18色谱柱(46 mm×150 mm,5 μm);流动相乙睛水28∶72;流速 10 mL·min-1;检测波长为267 nm;进样量20 μL。

对照品溶液的制备:精密称定党参炔苷对照品10 mg,以甲醇溶解并定容至2 mL,配成050 g·L-1的对照品溶液。

样品溶液的制备:称取各样品03 g,置具塞锥形瓶中,加入50 mL的甲醇,精密称重。超声处理30 min,放冷称重,加甲醇补足失重。摇匀静置,取上清液,用微孔滤膜(045 μm)过滤,取续滤液,即得。

标准曲线:取05 g·L-1的党参炔苷对照品溶液,依次稀释为48,24,12,6,3,15,075,0375 mg·L-1,进样20 μL,以峰面积积分值(X)为横坐标,以浓度(Y)为纵坐标,其回归方程为 Y=0000 044 810X+0144 534 179,R2=0999 9。党参炔苷质量浓度在0375~24 mg·L-1时呈现良好的线性关系。endprint

16数据处理

试验数据采用SPSS 230软件进行显著性检验(P<005)和Duncan多重比较。

2结果与分析

21不同施肥处理对党参生长的影响

211不同施肥处理对党参根长的影响

不同施肥条件下党参根长度见(表2),各处理间差异达显著水平(P<005)。同一生長时期下不同施肥处理对党参根长的影响如下。8月30日,根长最长的是处理C3(208 cm),与处理B,C1,E3,F2,F3差异显著。根长最短的是处理F3(120 cm),与除了F2的其他处理差异显著。最大长度为最小长度的17倍。9月30日,根长最长的是处理D1(281 cm),与处理C3,E2,F1,F2,F3差异显著。根长最短的是处理F3(200 cm),与其他处理差异显著。最大长度为最小长度的14倍。10月20日,根长最长的是处理D1(312 cm),与处理C1,C2,D2,F1,F2,F3差异显著。根长最短的是处理F3(266 cm),与除了F1的其他处理差异显著。最大长度为最小长度的12倍。总体来看,氮磷钾供应充分,地上部分枝繁叶茂,光合作用强,合成大量的有机物,相对运送到根的有机物较多,根生长较快[10]。本研究结果显示,磷肥对根的生长有一定的促进作用。同一施肥处理下,根长度最大的均为10月20日采收的党参,说明随着生长时间的延长白条党参的根长在不断增加。

212不同施肥处理对党参根直径的影响

不同施肥条件下党参根直径见(表3),各处理间差异达显著水平(P<005)。同一生长时期下不同施肥处理对党参根直径的影响如下。8月30日,根径最大的是处理B(443 mm),与处理E2,F2差异显著。各处理间没有显著差异,说明在这个时期施肥处理对根直径没有明显的促进作用。9月30日,施肥对鲜根直径的影响依次为氮肥>磷肥>有机肥>中草药专用肥。10月20日,施肥对鲜根直径的影响依次为氮肥>有机肥>磷肥>中草药专用肥。9月30日采收的样品,施用磷肥的根茎比有机肥的粗,10月30日采收的样品,施用有机肥的根茎比磷肥的粗。可能与有机肥的肥效比较慢而持久有关[11]。处理C1,C3,D1,D2,E1,F3的党参根直径在各个生长时期相对较高。氮肥的效果明显好于其他的施肥处理。这可能是因为根的横向生长靠的是细胞分裂,氮的多寡会直接影响植物的分裂,进而影响根的横向生长[10]。处理F1,F2,F3的鲜根直径均偏低,说明磷酸二胺可能不利于党参根直径的增加,也可能是土壤中速效磷的本底值较高,施用高磷的磷酸二胺对党参的生长产生了胁迫。同一施肥处理下,根直径最大的均为10月20日采收的党参,说明随着生长时间的延长白条党参的根粗在不断增加。

213不同施肥处理对党参根重的影响

不同施肥条件下党参单根干重见(表4),各处理间差异达显著水平(P<005)。无论施肥与否,党参的根干重随生育进程的增加而增加。在10月20日党参根干重达到最大,其中处理C1对党参根干重影响最为显著,与空白处理相比增加了4529%。在8月,各处理的单根重差异不大,而9月和10月的差异比较显著。这是因为9月中旬至10月中下旬,为根体积和根重极快速增加期[3,5]。处理C1,C2,C3在3个月份采收的党参干根重量均大于空白处理,这说明施氮肥对单根重的促进作用特别显著。氮是磷脂、蛋白质、核酸的组成成分,而这些物质又是细胞膜、原生质和细胞核的重要组成成分。氮也是叶绿素的成分,氮的多寡会直接影响植物的光合作用,进而影响植物的生长发育和物质积累[10]。在9月,磷肥的效果比有机肥的好,而在10月,有机肥的效果比磷肥的好。这可能跟有机肥的肥效比较慢而持久有关[11]。处理F1,F2,F3的根重在3个月份全部偏低,这可能是土壤中速效磷的本底值比较高,施用了高磷的磷酸二胺对党参的生长产生了胁迫。各施肥处理对根重的影响依次为氮肥>有机肥>磷肥>中草药专用肥。

22不同施肥处理对党参次生代谢物含量的影响

221不同施肥处理对党参炔苷含量的影响

不同施肥条件下党参炔苷含量表明(表5),各处理间差异达显著水平(P<005)。党参炔苷是党参中最重要的次生代谢物,也是党参的指标成分。无论施肥与否,党参炔苷含量随生育进程的增加而减少。其中,空白处理的党参炔苷含量降幅最大,达6770%;各施肥处理的降幅均小于空白处理。这表明施肥可以减缓党参炔苷含量在生长中后期下降的速度。8月30日,各处理党参炔苷含量均低于对照处理A(1102 mg·g-1)。9月30日和10月20日采收的党参中炔苷含量除处理D2外均高于空白处理。8月中旬至9月中旬是茎叶量极快速增重的花期,生长重心在茎叶上,根的生长缓慢[3,5],施肥对有效成分的稀释作用就凸显出来[12]。而进入9月中旬至10月中下旬的根体积和根重极快速增加期后,施肥对有效成分的促进作用就明显的表现出来了。9月30日和10月20日,处理E3根中党参炔苷的含量显著高于空白处理A,为处理A的123%~128%,说明施用有机肥5 8636 g·m-2最利于党参中炔苷的合成。不同施肥处理在一定程度上能促进党参炔苷的产生,但是促进效果不是特别显著。施肥对党参炔苷的影响依次为有机肥>氮肥>磷酸二胺>磷肥>中草药专用肥。这可能是由于党参炔苷属于多炔类化合物(次生代谢产物),而多炔类化合物合成是以碳水化合物作为底物,所以党参炔苷含量与其碳代谢有密切的关系。根据C/N平衡假说,施肥使植物体内碳水化合物含量升高,可使植物含氮量相对下降,引起非结构碳水化合物过剩,从而促进多炔类物质合成[1315]。

222不同施肥处理对党参多糖含量的影响

不同施肥条件下党参多糖含量(表6)表明,各处理间差异达显著水平(P<005)。无论施肥与否,党参多糖含量随生育进程的增加而增加。在10月20日党参多糖含量达到最大,其中处理D2对党参多糖影响最为显著,与空白处理相比增加了6631%。在3个月份中,处理D1,D2,D3,E1,E2,E3根中党参多糖的含量均大于空白处理A,以D2处理含量最高。这说明磷肥最有利于党参多糖的合成,有机肥其次。除了氮肥跟不施肥的差不多外,其endprint

他处理均利于多糖的产生。促进效果依次为磷肥>有机肥>中草药专用肥>磷酸二胺。这与王静等[16]得出的各营养元素对桔梗植株多糖含量影响为磷>氮>钾是一致的。这可能是因为施肥促进了光合作用的增强而提高了C的供应。多糖是以碳水化合物为底物,根据C/N平衡假说,P元素引起非结构碳水化合物过剩,从而促进多糖的合成。而N元素一方面提高了C/N中N的比例,另一方面施了N元素的党参产生了更多党参炔苷,这样相对产生的党参多糖的量就少了[1314]。从9月30到10月20日,多糖平均增加的幅度为3262%。其中,处理E1的增幅最大,达4993%。处理D2的增幅最小,为1691%。这可能跟有机肥的肥效比较慢而持久有关[11]。

23不同施肥处理对党参醇溶性浸出物的影响

按照《中国药典》2015年版醇溶性浸出物测定法下的热浸法测定,党参药材醇溶性浸出物的量不得少于550%。8月30日,处理C1,C3,E1,E2,E3,F1,F2,F3的党参醇溶性浸出物的量低于《中国药典》的规定(表7)。党参醇溶性浸出物含量最大的是处理D2(61675%)。9月30日,不同施肥处理的党参醇溶性浸出物的量均高于《中国药典》的规定。党参醇溶性浸出物量最大的是处理C1(73000%),党参醇溶性浸出物量最小的是处理A(55933%),最大含量为最小含量的13倍。10月20日,不同施肥处理的党参醇溶性浸出物的量均符

同一施肥处理下,除了极个别的处理其他处理中的党参醇溶性浸出物含量最大值均为10月20日采收的党参,说明随着生长时间的延长党参醇溶性浸出物含量在不断增加。

24不同施肥处理对党参产量的影响

单根重是药材产量形成的主要因素,产量以单根干重估测,不同施肥处理对党参产量的影响与对党参根重的影响一致(表8)。由于8月份党参还处于花铃期[5],不能作为成品使用,只需考虑9月30日和10月20的产量。除磷酸二胺外的各施肥处理均可增加党参的产量,影响大小依次为氮肥>磷肥>有机肥>中草药专用肥。相同施肥处理下,10月20日的产量均高于9月,产量平均提高了3399%,若仅考虑产量,9月下旬不是最佳采收期。

25不同施肥处理对党参采收期的影响

《中国药典》2015年版规定党参炔苷是党参的指标成分,但没有规定其含量的范围。在药材生产中,高产和优质往往不能兼得,合理的采收期的确定要充分考虑产量和有效成分的关系。在成分含量达到药典要求的基础上,含量与产量的乘积可将产量与品质相联系起来,以确定最合理的采收期。分析不同采样时间的党参炔苷含量与产量乘积(表9),各处理10月20日的党参炔苷含量与产量乘积与9月30日的差异不显著,10月20日的党参多糖含量与产量乘积显著大于9月30日。考虑到10月20日产量更大,无论施肥与否,10月20日可能是本试验区党参更加合理的采收期。

3讨论

合理施肥能够有效提高药用植物的产量和促进药用植物有效成分的累积[1621]。本研究通过设计施用不同肥料的栽培实验区获得相应的党参药材样品,以党参药材产量、党参炔苷含量和党参多糖含量为考察指标,研究了不同施肥处理对党参产量和有效成分含量的影响,为制定党参药材的合理栽培种植技术提供了参考。研究表明,施肥对党参根长无明显影响,但对党参根直径、单株根鲜质量和干质量影响明显。这与龚成文等[2]关于配方施肥对党参生产特性的影响的结论相一致。不同施肥处理对产量促进作用依次为氮肥>磷肥>有机肥>中草药专用肥。其原因是氮是构成植物功能蛋白、结构蛋白和光合器官的最重要的营养元素,施氮能明显增加作物的光合速率,从而提高产量[22]。研究发现,施肥对党参炔苷促进作用依次为有机肥>氮肥>磷酸二胺>磷肥>中草药专用肥。原因可能是生物有机肥不仅含有氮、磷、钾及其他微量元素,而且其中的有益微生物可对有机物进行降解和转化土壤养分,刺激作物根系的生长,促进作物对水分和矿质营养的吸收[23],使党参中的碳代谢变得十分旺盛,而党参炔苷含量与其碳代谢有密切的关系[1315]。本研究还得出,对于多糖,促进效果依次为磷肥>中草药专用肥>有机肥>磷酸二胺。结合不同施肥处理对党参产量和有效成分的影響,表明有机肥1 9545 g·m-2为最合理的施肥方案,有利于党参达到高产优质。含有氮、磷、钾的有机肥实际上是一种配方肥,它的效果比单因素肥效果好。这与曹鲜艳等[21]认为的配方施肥的效果比单因素施肥效果好是一致的,为了进一步完善党参的栽培种植技术,仍需对配方施肥进行深入的研究。

采收期是影响中药材产量与质量的重要环节,确定最佳采收期需要从药材的产量与质量等多个方面进行考虑。本研究创新性的使用了含量与产量的乘积,在成分含量达到药典要求的基础上,将产量与品质相联系起来,以确定最合理的采收期。研究表明,各处理10月20日的党参炔苷含量与产量乘积与9月30日的差异不显著,10月20日的党参多糖含量与产量乘积显著大于9月30日。得出了以下结论:无论施肥与不施肥,传统采收期不是最合理的采收期,10月下旬应是试验区党参更合理的采收期。

4结论

药材种植区药农沿袭下来的传统采收期的科学性和合理性值得考究。甘肃宕昌地区党参传统的采收期为9月下旬至10月上旬,此时党参的地下部分仍在生长,没有达到最大产量。在有效成分符合《中国药典》要求下,10月下旬应是该地区党参的合理采收期,其产量比9月下旬平均提高了3399%。在该地区适当施用有机肥可实现党参品质与产量的最优。

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