效应面法优化葛根素纳米晶自稳定Pickering乳液的稳定性

张继芬 张焦 王帆 王帅 王玫 易涛

[摘要]研制葛根素纳米晶自稳定Pickering乳液（puerarin nanocrystalline selfstabilized Pickering emulsion，PuNSSPE），采用BoxBehnken设计效应面法优化处方以提高其稳定性，研究药物浓度、水相pH和水油体积比对乳液的分层指数、乳液层的药物含量和乳滴粒径变化的影响。结果显示，当葛根素浓度为05%，水相pH为9，水油体积比为9时，能得到最稳定的PuNSSPE，乳滴粒径为（1270±117） μm，乳液层的药物浓度为（449±021） g·L-1，室温放置6个月后均无明显变化，稳定性好。采用扫描电镜、激光共聚焦显微镜和荧光倒置显微镜对乳滴结构进行表征，结果显示葛根素纳米晶能吸附于油滴界面形成稳定的球状核壳结构，这可能是PuNSSPE能够长期稳定的微观结构原因。

[关键词]葛根素； 纳米晶； Pickering乳液； 稳定性； BoxBehnken； 效应面法

Stability optimization of puerarin nanocrystalline selfstabilizied

Pickering emulsion by response surface methodology

ZHANG Jifen1， ZHANG Jiao1， WANG Fan1， WANG Shuai1， WANG Mei1， YI Tao2*

1 College of Pharmaceutical Sciences， Southwest University， Chongqing 400716， China；

2 School of Health Sciences， Macau Polytechnic Institute， Macau 999078）

[Abstract]A new Pickering emulsion， puerarin nanocrystalline selfstabilized Pickering emulsion （PuNSSPE） was developed BoxBehnken design was used for optimizing the preparation formulation of PuNSSPE to improve its stability， and the effects of concentration of puerarin， volume ratio of water to oil， and pH value of water phase on the stratification index of emulsion， droplet size and drug concentration in emulsion were investigated Results showed that the optimized PuNSSPE could be prepared with the concentration of puerarin of 05%， the volume ratio of water to oil of 9∶1 and the pH of water of 9 The size of emulsion droplet of optimized PuNSSPE was （1270±117） μm and the drug content was （449±021） g·L-1 The above indexes had no significant changes within the storage of 6 months at room temperature， indicating good stability Microstructure characterizations by scanning electron micrograph， confocal laser scanning microscope and fluorescence microscope showed that the optimized PuNSSPE had a stable coreshell structure of emulsion droplet formed by the adsorption of puerarin nanocrystallines at the surface of oil droplets， which may be the microstructure reason for the long stability of PuNSSPE.

[Key words]puerarin； nanocrystalline； Pickering emulsion； stability； Boxbehnken design； response surface methodology

Pickering乳液是一種以固体微粒，如二氧化硅[1]、二氧化钛[2]等作为稳定剂的乳液。固体微粒不可逆地吸附于油水界面，形成稳定的膜状结构，阻止液滴合并而稳定乳液。与传统乳液相比，Pickering乳液不需要使用表面活性剂，安全性更高，且具有更好的热力学稳定性[1]，是一种潜在的优良给药系统，已在皮肤局部给药[34]、口服给药[56]中有所研究应用。课题组以难溶性药物自身纳米晶作为固体微粒稳定剂制备一种新型Pickering乳液，即药物纳米晶自稳定Pickering乳液（nanocrystalline selfstabilized Pickering emulsion，NSSPE）；与传统Pickering乳液比较，无异种固体微粒的存在，进一步增强了安全性；而药物除了溶解于油相，还大量吸附于油水界面，可提高制剂载药量，已成功用于提高水飞蓟宾的口服生物利用度[7]。

通脉复方由葛根、川芎、丹参配伍组成，具有活血通脉的功效，可用于缺血性心脑血管疾病，动脉硬化，脑血栓，脑缺血，冠心病，心绞痛的治疗。课题研究的最终目标是构建通脉复方的NSSPE新制剂。鉴于NSSPE是一个很新的给药系统，很多问题还没弄清楚，直接用于通脉复方有很大难度，故先以方中的主要药效成分葛根素单体为模型进行研究。处方中的川芎中含川芎油，具有镇痛、镇静、改善血管功能、保护神经细胞等药理作用[8]，对通脉方的疗效有一定贡献。考虑到将来复方给药的应用，选择以川芎油作为主要油相，制备NSSPE。

课题组已对NSSPE用于葛根素（puerain，Pu）的可行性进行了前期研究。结果显示，以川芎油与Labrafil M 1944 CS的混合油为油相，当Pu质量浓度在01%～05%，水相pH呈碱性，水油体积比在95∶5～80∶20时可制得PuNSSPE[9]。为了提高PuNSSPE的长期稳定性，本研究在前期基础上，采用Boxbehnken设计效应面法优化PuNSSPE的制备，研究药物浓度、水相pH和水油体积比之间的相互作用及其对稳定性影响，评价优化后PuNSSPE的长期稳定性，表征其微观结构，探讨其长期稳定的原因，为难溶性药物NSSPE的深入研究提供基础。

1材料

FA2004A电子天平（1/1 万，上海精天电子仪器有限公司）；FA25高速剪切机（上海弗鲁克流体机械制造公司）；AH100D高压均质机（加拿大ATS工业系统有限公司）；光学生物显微镜（集成Cool SNAP Photomerics光学采集系统，OPTEC奥特光学公司）；佳能IXUS1100HS数码相机（佳能中国有限公司）；荧光倒置显微镜（DFC310 FX，德国Leica）；纳米粒度及Zeta电位分析仪（Zetasizer Nano ZS，英国马尔文仪器公司）；LC20AD高效液相色谱系统（日本岛津公司）；JSM7800F扫描电镜（日本电子株式会社）；激光共聚焦显微镜（日本尼康有限公司）。

Pu原料药（纯度98%，四川玉鑫药业有限公司）；油酸聚乙二醇甘油酯（Labrafil M 1944 CS，法国佳法赛试剂有限公司）；川芎油（江西雪松天然药用油有限公司）；尼罗红（上海源叶生物有限公司），其余试剂均为分析纯。

2方法

21PuNSSPE的制备

称取一定量的Pu加入到一定体积的油相中（川芎油Labrafil M 1944 CS 9∶1），水浴超聲2 min分散均匀，再加入一定体积的不同pH的水相，油水总体积固定为100 mL，19 000 r·min-1高剪切2 min混合均匀，8万KPa高压乳匀3 min，即得[9]。

22BoxBehnken设计

根据前期研究结果[9]，以Pu质量浓度（X1）、水相pH（X2）和水油体积比（X3）为因素，以乳液的分层指数（Y1）、乳液层的药物含量（Y2）和乳滴粒径的变化率（Y3）为指标，采用3因素3水平的BoxBehnken设计对PuNSSPE的制备进行优化。各因素水平见表1，各指标目标分别为Y1，Y3越小越好，Y2越大越好。

23乳液的评价指标

231分层指数的测定将制得的样品装于玻璃瓶中，室温静置1个月，观察分层、絮凝、沉淀等现象，用数码相机拍摄外观照片，测定乳液层的高度，按下式计算分层指数[10]：分层指数=[1-（H1/H0）]×100%，H0，Ht分别为0时刻和1个月后乳液层的高度。对于完全失去乳液形态的样品，分层指数设为100%。

232乳液层的药物含量测定将制得的样品装于玻璃瓶中，室温静置1个月，取100 μL PuNSSPE乳液层样品于10 mL量瓶中，加入600 μL氯仿甲醇2∶1混合溶液，振摇使药物溶解完全，甲醇定容，15 000 r·min-1离心10 min，取上清液用HPLC测定葛根素。色谱条件：色谱柱为UltimateXBC18（46 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇01%柠檬酸水溶液29∶71，流速为1 mL·min-1，检测波长为250 nm，柱温为30 ℃。对于完全失去乳液形态的样品，乳液层的药物含量设置为0。

233乳滴粒径变化率的测定取乳液1滴，均匀涂于玻片上，光学显微镜观察乳滴形态，集成Cool SNAP Photomerics光学采集系统拍摄照片，并用USB20 Gamer软件计数200个乳滴的粒径，按下式计算平均体积径（d43d）[11]。每份样品重复5次，取平均值。

d43d=d4id3i

分别在0时刻和室温静置1个月后计算粒径，按下式计算粒径变化率：粒径变化率=[（d1/d0）-1]×100%，d 0，d1分别为0时刻和1个月后乳液层的d43d。对完全失去乳液形态的样品，粒径变化率设置为100%。

24PuNSSPE的长期稳定性

按优化处方制备的PuNSSPE在室温下静置6个月，每月取样，测定其外观、乳滴粒径、乳液层的药物含量和Zeta电位的变化。

25PuNSSPE的微观结构表征

251扫描电镜观察按优化条件制备PuNSSPE，同法制备不加油相的Pu纳米晶混悬液和不加Pu的油水混合液作为对照品。分别取少量乳液和1 h内制备的对照品点样于硅胶薄膜上，自然挥干，用扫描电镜观察比较乳液的形态、大小和结构。

252激光共聚焦显微镜观察取少量尼罗红溶于油相中，按优化条件制备PuNSSPE。将所得乳液点样于载玻片上，用激光共聚焦显微镜观察尼罗红的荧光斑点，激发波长为488 nm，发散波长为570 nm。

253荧光倒置显微镜观察按优化条件制备PuNSSPE，以同法制备不加油相的Pu纳米晶混悬液，不加Pu的空白乳液和Pu原料药作为对照品。分别取少量乳液和对照品点样于载玻片上，置于荧光倒置显微镜下观察Pu的荧光斑点，激发波长为258 nm，发射波长为471 nm。

3结果

31BoxBehnken设计

311各样品评价结果按BoxBehnken优化设计，制备了17份样品。室温放置1个月后的外观见图1。可见第9，11，12，14～16号样品已完全不成乳状。基于BoxBehnken设计实验的内容与测量响应结果见表2。

312指标回归方程的拟合利用SPSS软件对表2数据按照Y=A0+A1X1+A2X2+A3X3+A4X1X2 +A5X2X3+A6X1X3+A7X12 + A8X22+A9X32形式进行二次多元回归拟合，其中Y是与每个因素水平紧密相关的响应项，A0为截距，A1～A9为回归系数。拟合结果如下：Y1 =2180109 -449593X2 -1276X3 + 151135X12 + 23568X22 +0634X32 （r=0941，F=16868，P=0000）；Y2 =-9675 +11080X1 +21213X2 -13783X12-1183X22-0030X32 +0076X2X3（r=0950，F=15022，P=0000）；Y3=1 600230-318876X2-14582X3+145040X21+16.335X22+0.749X23（r=0910，F=10545，P=0001）。

回归方程的相关系数r接近于1，P<0001说明模型拟合程度好，可以用此模型对PuNSSPE处方进行分析和预测。

313效应面分析选择对各指标有显著影响的2个因素，另一因素则设为中心点值，用origin 60绘制三维效应面图和等高图，结果见图2～4。

Pu浓度对分层指数有显著影响，随着Pu浓度（X1）增加，分层指数（Y1）显著增大（图2B，2C）。当水相pH（X2）从8增大到9时，分层指数随其增大而减小；而当水相pH从9继续增加到10时，分层指数不再有显著变化（图2A，2C）。当水油体积比（X3）从4增大到9时，分层指数随其增大而减小；而当水油体积比从9继续增加到16时，分层指数反而随之增大（图2A，2B）。

由图3可知，随着各因素水平的增加，乳液层Pu含量（Y2）均是先增大后减小。当Pu浓度（X1）从01%增大到05%，水相pH（X2）从8增大到9，水油体积比（X3）从4增大到9时，乳液层Pu含量分别随其增加而增大；而当Pu浓度超过05%，水相pH超过9后，水油体积比超过9后，乳液层Pu含量反而随之降低。

圖4显示，乳滴粒径变化率（Y3）明显受到Pu

浓度（X1）、水相pH（X2）和水油体积比（X3）的影响。增大水相pH，减小Pu浓度，均可使粒径变化率降低。当水油体积比为4～10时，增大水油体积比，粒径变化率降低；在10～16内，增大水油体积比，粒径变化率增大。

314优选处方的预测与验证根据所绘制三维效应面图和等高图，优选各因素的较佳取值范围，得到最终的优化处方条件为：葛根素浓度为05%，水相pH为9，水油体积比为9。按此优化处方制备了3批PuNSSPE，测定各响应指标。实际测量值与模型对各指标的预测值见表3。结果显示，实际测量值与模型预测值接近或者优于预测值，表明各指标的优化过程可靠，模型的预测性良好，而且优化处方制备的PuNSSPE的稳定性更好。

32优化后PuNSSPE的长期稳定性

按优化处方制备的PuNSSPE在室温下静置6个月的稳定性结果见表4。

室温存储6个月后，PuNSSPE的外观无明显变化，无油相析出，无葛根素絮凝。在6个月考察期间，乳滴的粒径、葛根素的含量与0月相比，均无显著性差异。自第3个月起，Zeta电位虽然有变化，但仍在-40 mV左右。

33PuNSSPE的结构表征

331扫描电镜扫描电镜图见图5，葛根素纳米

晶（图5A）呈不规则的四边形片状结晶，粒径约为（39086±11864） nm。不加药物的空白油滴（图5B）呈光滑的球形，粒径约为（452±105） μm。PuNSSPE（图5C，图5D）的乳滴粒径约为（1554±277） μm，为空白油滴的3倍；仍保持球状，但与空白油滴不同的是，乳滴表面不平整，有大量明显突起，推测应是Pu纳米晶包裹于油滴表面所致。

332激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜图见图6A，溶有尼罗红的乳滴显现红色荧光。同一样品在自然光下观察到的普通光学显微图见图6B，乳滴显现黑色，在乳滴油水界面有明显的光圈。用仪器自带软件将A，B 2图重叠得到图6C，可见图6B的黑色乳滴与图6A的红色荧光乳滴完全重合，而且在红色荧光乳滴界面有明显的光圈。

333荧光倒置显微镜Pu原料药、Pu纳米晶混悬液、空白乳和PuNSSPE在荧光显微镜下的观察结果见图7。可见，Pu本身具有蓝色荧光，制成纳米晶后Pu晶体由较大的四边形片状（图7A）变成

A Pu纳米晶；B空白油滴；C载药PuNSSPE乳滴；D载药PuNSSPE乳滴表面。

小的类球形（图7B）。在PuNSSPE中可见到大量粒径较大[约为（1193±272） μm]的圆形或椭圆形乳滴，乳滴表面蓝色荧光较强，而内部较弱（图7E和F），与空白乳（图7D）的一片漆黑形成明显差异。

4讨论

41PuNSSPE稳定性的评价指标

乳液是一种非均相的粗分散体系，容易出现分层、絮凝、合并等不稳定现象。分层指数和乳滴粒径

的变化率可以准确反映乳液的这些不稳定现象，是目前Pickering乳液稳定性评价的常用指标。良好的PuNSSPE不仅要稳定，还要具有较高的Pu含量，因此，增加了乳液层的药物含量作为优化指标。预试实验时，样品观察了3个月，结果发现，1个月后各指标均无明显变化，故在工艺优化时选择

A488 nm激发波长下的激光共聚焦图；B自然光下的光学显微图；C将A和B叠加，显示完全重合。

A葛根素原料药；B葛根素纳米晶；C自然光的空白乳；D荧光下的空白乳；EFPuNSSPE。

1个月作为稳定性的考察时间。而在对优化工艺制备的PuNSSPE进行稳定性评价时，考察时间延长至6个月。

42影响PuNSSPE稳定性的处方因素及其相互作用

影响Pickering乳液稳定性的因素有油相组成和用量、微粒性质、水相pH和离子强度等，其中最重要的因素是微粒的润湿性和粒径[12]。药物浓度、水油体积比和水相pH之间存在交互影响：水相pH能影响药物溶解度和电荷，油相用量影响油滴的数量和比表面积，加入的药物浓度影响纳米晶稳定剂的粒径和分散性，这些因素对Pickering乳液均有不同影响，最终Pickering乳液的稳定性是其综合作用的体现[1314]。

本研究优化的3个影响因素中，Pu浓度对乳液的形成与稳定影响最大：Pu浓度增大，乳液的稳定性降低。其原因在于：Pu浓度增大后，纳米晶粒度增大，分散性变差，在油滴表面的吸附能力变差[15]。当浓度达到08%时，制得的葛根素纳米晶达到微米级，30 min内就已大量聚集成絮状物，因此，08%浓度制备的样品（第11，12，14，15号）稳定性差，几天内就已出现明显絮状聚集现象。

水油体积比和葛根素浓度之间关系比较复杂。如果减小水油体积比，一方面由于油相用量增加，形成的乳滴数量增加，比表面积增大，油滴界面需要吸附更多的Pu纳米晶才能保持稳定；另一方面由于Pu在水相中的溶解度远大于油相，水相体积减少使得溶解的Pu量显著减少，混悬的Pu纳米晶增多。如果混悬的Pu纳米晶量大于油滴界面的吸附量，相对过剩的Pu纳米晶就容易聚集使乳液稳定性降低。反之，如果混悬的Pu纳米晶量小于油滴界面的Pu纳米晶吸附量，Pu纳米晶就不能完全包裹油滴；而且Pu浓度增大后，纳米晶粒度增大，在油滴表面的吸附能力变差，乳滴稳定性变差，易合并。油相用量高达20%制备的样品（第7～9，14号）放置30 d后油相析出明显就是很好的证明。

水相pH可以影响固体微粒的溶解性、电荷、粒径和分散性，进而影响Pickering乳液的稳定性[1617]。当水相pH为8～10时，增大pH有利于PuNSSPE的稳定。水相pH增大，葛根素溶解度仅略有增加，纳米晶粒径略有减小，在200～300 nm，产生的影响较小；而Zeta电位显著降低，使纳米晶之间的电荷斥力作用减弱，有利于吸附于乳滴界面[17]。前期的单因素实验对水相pH进行了考察，制备了水相pH分别为3，5，7，9的PuNSSPE，测得乳液的Zeta电位分别为-449，-420，-501，-496 mV。不同pH条件下乳液的zeta电位差异不大，推测高pH条件有利于PuNSSPE的稳定与乳液的Zeta电位变化无关。

43影响PuNSSPE稳定性的微观结构分析

SEM观察发现葛根素纳米晶粒径约为（39086±11864） nm，大于用纳米粒度分析仪测得的（25070±5060） nm，形态也不同于荧光显微镜下观察到的结果。原因可能是，扫描电镜观察时，需先将样品自然干燥，而葛根素纳米晶热力学不稳定，在干燥过程中可能会聚集使粒径增大，形态改变。

PuNSSPE的乳滴粒径明显大于空白油滴，表面不光滑平整，有大量突出物，显示Pu纳米晶可能吸附在油滴表面。激光共聚焦显微镜和荧光显微镜的观察结果进一步证实了PuNSSPE乳滴的微观结构，即在油滴外層Pu纳米晶形成了较为坚实的外壳，能够支撑其球形结构，因而具有较高的稳定性。

目前，激光共聚焦显微镜的激发波长有405，488，561，640 nm。尼罗红的激发波长为488 nm，葛根素的激发波长为258 nm，故用激光共聚焦显微镜可观察到PuNSSPE乳滴中尼罗红的红色荧光，而不能观察到葛根素的蓝色荧光。由图6C可见在红色乳滴外有明显的光圈，可能为葛根素吸附于油滴界面而成。考虑到标记后葛根素荧光结合物的性质可能不同于葛根素，不一定能吸附于油水界面，因此本研究未将葛根素用荧光标记后再观察。为了直接观察到葛根素的分布，选用了荧光倒置显微镜法，因为葛根素自身的蓝色荧光在荧光显微镜下可见（图7A）。图7（C，D）显示，不加Pu的空白乳在普通光学显微镜下能看到乳滴，但川芎油无荧光，在荧光显微镜下一片黑。图7（E，F）显示，乳滴界面有较强的荧光，内部荧光较弱，证实在PuNSSPE中，Pu一部分溶解于油相中，另一部分以纳米晶形式吸附在乳滴的油水界面上。

44Pu的界面吸附率

实验中，按照PuNSSPE的制备过程制备了不含油相的Pu纳米晶混悬液，测得其水中溶解的Pu质量浓度为（225±064） g·L-1；测得油相中Pu的溶解度极低，仅为（1517±023） mg·L-1，成品乳液中Pu质量浓度425 g·L-1，由此推测约有47%的Pu吸附于乳滴的油水界面。测得的Pu溶解度低于一些文献报道。文献报道Pu溶解度在26～46 g·L-1不等[1819]。可能是因为Pu的晶型不同，Pu的溶解度与其晶型有关[20]。

[参考文献]

[1]Kim I J， Worthen A J， Johnston K P， et al Sizedependent properties of silica nanoparticles for Pickering stabilization of emulsions and foams [J] J Nanopart Res， 2016， 18（4）： 1

[2]Lyua B， Wang H D， Ma J Z， et al Preparation and application of castor oil/nanoTiO2 composite fat liquoring agent via a Pickering emulsion method [J] J Clean Prod， 2016， 126： 711

[3]Salerno A， Bolzinger M A， Rolland P， et al Pickering emulsions for skin decontamination [J] Toxicol in Vitro， 2016， 34： 45

[4]Wahlgren M， Engblom J H， Sjoo M L， et al The use of microand nanoparticles in the stabilisation of Pickeringtype emulsions for topical delivery [J] Curr Pharm Biotechnol， 2014， 14（15）： 1222

[5]Spomenka S， He H， Yunmei S， et al An oral delivery system for indomethicin engineered from cationic lipid emulsions and silica nanoparticles [J] J Controlled Release， 2010， 143： 367

[6]Angel T， Spomenka S， Andrew K D， et al Silicalipid hybrid （SLH） microcapsules： a novel oral delivery system for poorly soluble drugs [J] J Controlled Release， 2009， 134： 62

[7]张继芬， 刘川， 张焦， 等 水飞蓟宾纳米晶自稳定Pickering乳液的制备及评价[J] 药学学报， 2016， 51（5）： 813

[8]杜旌畅， 谢晓芳， 熊亮， 等 川芎挥发油的化学成分与药理活性研究进展[J] 中国中药杂志， 2016，41（23）： 4328

[9]张焦， 王帆， 王计瑞， 等 葛根素纳米晶自稳定Pickering乳液的制备可行性研究[J] 中草药， 2017，48（1）：75

[10]Han N L， Tang C H pHdependent emulsifying properties of pea [Pisu msativum （L）]proteins [J] Food Hydrocolloid， 2013， 33 （2）： 309

[11]Joe F， Paul S C Using a molecular stopwatch to study particle uptake in Pickering emulsions [J] Langmuir， 2016， 32： 6387

[12]Duffus L J， Norton J E， Smith P， et al A comparative study on the capacity of a range of foodgradeparticles to form stable O/W and W/O Pickering emulsions [J] J Colloid Interf Sci， 2016， 473： 9

[13]Feng Y M， Lee Y Surface m odification of zein colloidal particles with sodium caseinateto stabilize oilinwater Pickering emulsion [J] Food Hydrocolloid， 2016， 56： 292

[14]Xiao J， Li Y Q， Huang Q R Recent advances on foodgrade particles stabilized Pickering emulsions： fabrication， characterization and research trends [J] Trends Food Sci Tech， 2016， 55： 48

[15]Manga M S， Cayre O J， Williams R A， et al Production of solidstabilised emulsions through rotational membrane emulsification： influence of particle adsorption kinetics [J] Soft Matter， 2012， 8（5）：1532

[16]Zhang M， Wang A J， Li J M， et al Factors influencing the stability and type of hydroxyapatite stabilized Pickering emulsion [J]. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl C， 2016， 70：396

[17]Mwangi W W， Ho K W， Tey B T， et al Effects of environmental factors on the physical stability of Pickering emulsions stabilized by chitosan particles [J] Food Hydrocolloids， 2016， 60： 543

[18]潘見，张勇，袁传勋 葛根素的多晶型研究[J] 药物分析杂志，2004，24（2）：119

[19]向大位，唐甜甜，龚友兰，等 以葛根素为模型药物的口服微乳研究[J] 中南药学，2010，5（8）：329

[20]李颖，潘卫三，陈士林，等 葛根素磷脂复合物的制备及其固体分散体研究[J] 中国药学杂志，2006，41（5）：1162

[责任编辑孔晶晶]