抗性和敏感生物型菵草代谢精唑禾草灵的速度差异

颜欣茹+杨俊雪+薛君+刘嘉慧+李凌绪

摘要：为了测定菵草抗性生物型SD-04-SS和敏感生物型SD-12对精唑禾草灵代谢速度的差异，建立了精唑禾草灵及其主要代谢产物精唑禾草酸、6-氯苯并唑酮的高效液相色谱（HPLC）分析方法。结果表明，在0.123～30.000 μg/mL范围内、0.977～1 000.000 μg/mL范围内、0.469～30.000 μg/mL范围内6-氯苯并唑酮、精唑禾草酸、精唑禾草灵浓度与响应值线性关系良好，相关系数（r）分别为0.991 2、0972 2、0.996 3。应用上述方法分析发现，精唑禾草灵处理后2 h在菵草体内即可检测到精唑禾草酸和6-氯苯并唑酮，药后2～96 h抗性生物型SD-04-SS体内精唑禾草灵的含量始终略高于敏感生物型SD-12，药后24～72 h抗性生物型SD-04-SS体内精唑禾草酸的含量显著低于敏感生物型SD-12，说明抗性生物型降解精唑禾草酸的速度比敏感生物型更快。

关键词：菵草；精唑禾草灵；代谢；高效液相色谱；除草剂抗性

中图分类号：S482.4文献标志码：A文章编号：1003-935X（2017）01-0015-05

Differences in Metabolism Rate of Fenoxaprop-P-Ethyl Among

Beckmannia syzigachne Biotypes

YAN Xinru，YANG Junxue，XUE Jun，LIU Jiahui，LI Lingxu

（Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China）

Abstract： An HPLC method was developed to analyze the concentration of fenoxaprop-P-ethyl，fenoxaprop-P and 6-chlorobenzoxazolone in Beckmannia syzigachne，and to determine differences in the rate of fenoxaprop-P-ethyl degradation between the resistant biotype SD-04-SS and susceptible biotype SD-12. Excellent linearity was obtained in the range of 0.123-30 μg/mL，0.977-1000 μg/mL and 0.469-30 μg/mL for 6-chlorobenzoxazolone，fenoxaprop-P and fenoxaprop-P-ethyl，respectively，with correlation coefficient of 0.9912，0.9722 and 0.9963，respectively. The method was employed to analyze the concentration of fenoxaprop-P-ethyl，fenoxaprop-P and 6-chlorobenzoxazolone in both biotypes. Fenoxaprop-P and 6-chlorobenzoxazolone could be detected in B. syzigachne 2 hours after treatment with fenoxaprop-P-ethyl. The concentration of fenoxaprop-P-ethyl in SD-04-SS （R） was always higher than that in SD-12 （S） within 2～96 hours after treatment （HAT），but the concentration of fenoxaprop-P in

收稿日期：2016-12-20

基金项目：国家自然科学基金（编号：31301680）；青岛农业大学2015年大学生科技创新基金。

作者简介：颜欣茹（1995—），女，本科生。E-mail：2323458818@qq.com。

通信作者：李凌绪，博士，副教授，主要从事杂草抗药性研究。E-mail：lingxulipvi@126.com。SD-04-SS （R） was always higher than that in SD-12 （S） within 24～72 hours. Thefore the resistant biotype SD-04-SS degrades fenoxaprop-P faster than the susceptible biotype SD-12.

Key words： Beckmannia syzigachne；fenoxaprop-P-ethyl；metabolism；HPLC；herbicidal resistance

菵草（Beckmannia syzigachne）为禾本科菵草属一年生杂草，是长江中下游地区稻茬麦田的主要杂草之一[1-3] 。精唑禾草灵（fenoxaprop-P-ethyl）属于乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）抑制剂类除草剂，是小麦田苗后选择性防治禾本科杂草的主要除草剂品种之一。精唑禾草灵在禾本科杂草体内代谢为精唑禾草酸（fenoxaprop-P）起到除草作用，精唑禾草酸进一步代谢为6-氯苯并唑酮（6-chlorobenzoxazolone）等化合物后失去除草效果[4-5]。我国自1990年代開始应用精唑禾草灵防除稻茬麦田菵草，如今江苏、安徽、山东等部分地区的菵草已对精唑禾草灵产生了抗性[6-9]。笔者所在课题组发现采自山东省鱼台县的SD-04生物型对精唑禾草灵产生了236.8倍抗性，克隆其ACCase序列测序比对后在其ACCase CT亚基上鉴定出了已知的抗性位点Gly-2 096-Ala[10]。应用CAPS技术从SD-04生物型中分离到2 096 位等位基因野生型SD-04-SS，经生物测定后发现SD-04-SS对精唑禾草灵仍然有635倍抗性[11]，可见SD-04-SS很可能存在对精唑禾草灵的非靶标抗性，代谢速度差异可能是其抗性机理之一。为了明确SD-04-SS与敏感型菵草代谢精唑禾草灵的速度是否存在差异，本研究建立了分析菵草体内精唑禾草灵及其主要代谢产物精唑禾草酸、6-氯苯并唑酮含量的高效液相色谱（HPLC）方法，并测定了抗性生物型菵草SD-04-SS和敏感型菵草SD-12体内精唑禾草灵及其主要代谢产物精唑禾草酸的含量，以明确抗性生物型SD-04-SS和敏感生物型SD-12代谢精唑禾草灵及精唑禾草酸速度的差异。

1 材料與方法

1.1 材料

供试杂草：抗性生物型菵草SD-04-SS是分离自精唑禾草灵抗性生物型SD-04的等位基因野生型植株，敏感生物型SD-12采自山东省泰安市渿河公园。

供试药剂：精唑禾草灵对照品（阿拉丁）、精唑禾草酸对照品（Dr. Ehrenstorfer GmbH）、6-氯苯并唑酮对照品（Sigma-Aldrich）、95%精唑禾草灵原药（山东滨农科技有限公司）、甲醇（色谱纯）、超纯去离子水，其余试剂均为分析纯。

仪器：Agilent 1200型高效液相色谱仪（含VWD紫外检测器）、手动进样器、柱温箱、工作站（美国安捷伦公司）；3WP-2000型自行式喷雾塔（农业部南京农业机械化研究所）。

1.2 方法

1.2.1 杂草培养与样品制备 菵草种子萌发参考Li等的方法[12]，待种子萌发后种入装有壤土的塑料花盆中（直径20cm），每盆植入8株，在温室内培养至两叶一心期间苗，保留长势一致的5株幼苗，然后剪去地上部分，待其长出新叶以增加受药的面积。菵草重新长到三叶一心期时用3WP-2000型自行式喷雾塔喷施精唑禾草灵，用量为310.5 g a.i./hm2。分别在药剂处理后2、8、24、48、72、96、144 h剪下地上部分，称质量，立即在液氮中磨碎，加入3倍体积（V/m）甲醇室温下微波振荡提取60 min，提取液12 000 r/min离心，取上清液。上清液用氮气吹干，用5 mL甲醇重新溶解定容，经0.22 μm滤膜过滤，取滤液作为供试样品溶液。试验中以每3盆菵草为1个处理，每处理重复3次。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 色谱条件 色谱柱为Shim-pack VP-ODS-C18柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇 ∶ 水=8 ∶ 2，体积流量为0.8 mL/min，检测波长为238 nm，进样量为20 μL，柱温为25 ℃。

1.2.2.2 线性关系 考察精密称取6-氯苯并唑酮，用甲醇配制成0.123～30 μg/mL的系列标准溶液，取上述系列标准溶液进样 10 μL，以峰面积积分值为纵坐标、质量浓度为横坐标制作标准曲线。同法测得其他2种成分的回归方程和线性范围。

1.2.2.3 加样回收率 试验精密称取精唑禾草灵、精唑禾草酸、6-氯苯丙唑酮3种对照品各1 mg，用甲醇溶解，配制成3种药品的浓度均为 100 μg/mL 的混合溶液。取未喷施精唑禾草灵的菵草，按“1.2.1”节的方法制得提取液，用提取液将上述药品混合溶液稀释成1、10、30 μg/mL，分别进样，测定3种对照品在不同浓度下的回收率（n=3）。

1.2.3 不同生物型菵草代谢精唑禾草灵速度差异的分析 取供试样品溶液，进样20 μL，以外标法用峰面积积分值计算菵草中精唑禾草灵、精唑禾草酸和6-氯苯并唑酮的含量。

2 结果与分析

2.1 分析方法

在上述色谱条件下，检测得目标化合物精唑禾草灵、精唑禾草酸和6-氯苯并唑酮的保留时间分别是15.841、4.489、3.364 min，分离度良好（图1）。

线性关系考察得到6-氯苯并唑酮的回归方程为y=66.448x+46.056，r2=0.991 2，线性范围为0.123～30.000 μg/mL；精唑禾草酸回归方程为y=52.478x+1 971.1，r2=0.972 2，线性范围为0.977～1 000.000 μg/mL；精唑禾草灵回归方程为y=87.726x+38.241，r2=0.996 3，线性范围为0.469～30.000 μg/mL。

加样回收率试验结果（表1）表明，精唑禾草灵的回收率在91.0%～98.0%之间，RSD为53%～7.9%；精唑禾草酸的回收率在80.0%～112.1%之间，RSD为4.9%～12.5%；6-氯苯丙唑酮回收率在96.0%～104.0%之间，RSD为7.8%～12.6%。

2.2 不同生物型菵草代谢精唑禾草灵速度差异的分析

2.2.1 样品中精唑禾草灵含量的变化 在药后2～144 h，SD-04-SS生物型和SD-12生物型中精唑禾草灵的含量呈不断下降趋势，SD-04-SS生物型精唑禾草灵的含量总体略高于SD-12生物型。SD-04-SS生物型和SD-12生物型中精唑禾草灵的含量在药后2 h到药后 8 h 略有下降，在施药后8 h后开始快速下降，施药后 72 h 后精唑禾草灵含量下降的速度趋缓，施药后 96 h 后SD-04-SS生物型和SD-12生物型的精唑禾草灵含量已基本相同（表2）。

2.2.2 样品中精唑禾草酸含量的变化 精唑禾草酸是精唑禾草灵在杂草体内被水解后的产物，是起到除草作用的活性成分。由表3可知，在施药后2 h即可在菵草中检测到精唑禾草酸，说明精唑禾草灵在施用后很快就被菵草吸收降解，这与前人在土壤微生物和大穗看麦娘上的研究[13-14]一致。在药后2～144 h，SD-04-SS生物型和SD-12生物型中精唑禾草酸的含量呈不断上升的趋势。药后2、8 h，SD-04-SS生物型和 SD-12生物型精唑禾草酸的含量并无明显差异，但药后24～144 h生物型SD-12的精唑禾草酸含量显著高于抗性生物型SD-04-SS，说明在此时间段内抗性生物型SD-04-SS降解精唑禾草酸的速度快于敏感生物型 SD-12，这与2种生物型对精唑禾草灵的敏感性呈现负相关。

2.2.3 样品中6-氯苯并唑酮含量的变化 精唑禾草酸在杂草体内进一步代谢为6-氯苯丙唑酮后失去除草活性，经HPLC测定，抗性生物型SD-04-SS和敏感生物型SD-12生物型体内6-氯苯丙唑酮的含量呈缓慢增加趋势，在施药后2 h即可检测到6-氯苯丙唑酮的存在（表4），说明敏感生物型和抗性生物型都能具备把精唑禾草酸降解为6-氯苯丙唑酮的能力。在施药后2～144 h，敏感生物型和抗性生物型菵草体内6-氯苯丙唑酮含量均无规律性变化，说明6-氯苯丙唑酮含量不能体现菵草是否存在对精唑禾草灵的抗性，类似的现象曾在小麦和敏感马唐、抗性大穗看麦娘和敏感大穗看麦娘之间观察到过[2-3]。

3 结论与讨论

精唑禾草酸是精唑禾草灵在杂草体内的主要代谢产物，是起到除草作用的活性成分，被进一步代谢为6-氯苯丙唑酮后失去活性。杂草可通过降低精唑禾草灵水解的速度或加速精唑禾草酸的降解以降低体内精唑禾草酸的含量，减轻或免受除草剂的毒害作用。在杂草抗性研究中，一般采用放射性同位素标记-高效液相色谱法对目标化合物进行分析。该方法灵敏可靠，可对样品进行定性和定量分析，但同位素标记试剂会损害身体健康、价格昂贵、废弃物难以处理，而且需要在专门的实验室借助于专门设备才能进行。高效液相色谱分离效率高、灵敏、快速、准确，相比放射性同位素标记法其成本低廉、对人体健康影响小、废弃物易处理。本研究建立的精唑禾草灵及其主要代谢产物的HPLC分析方法稳定、可靠，能反映出不同生物型菵草降解精唑禾草灵和精唑禾草酸速度的差异，具有更好的适用性。

本研究发现，在施药后2 h就能在菵草体内检测到精唑禾草酸和6-氯苯丙唑酮的存在，说明菵草很快就能吸收精唑禾草灵并进行代谢反应。从药后24 h开始，敏感生物型体内的精唑禾草酸含量显著高于抗性生物型，说明抗性生物型 SD-04-SS降解活性成分精唑禾草酸的速度显著快于敏感生物型SD-12，这是SD-04-SS生物型对精唑禾草灵产生抗性的代谢基础。

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