2型糖尿病性牙周病患者唾液中白细胞介素6含量测定①

刘陆滨,赵禹仲,孙启菲,赵 亮

(佳木斯大学附属口腔医院，黑龙江 佳木斯 154002)

2型糖尿病性牙周病患者唾液中白细胞介素6含量测定①

刘陆滨,赵禹仲,孙启菲,赵 亮

(佳木斯大学附属口腔医院，黑龙江 佳木斯 154002)

目的：测定2型糖尿病性牙周病患者口腔唾液中白细胞介素6(IL-6)的含量。方法：利用Bio-Plex 悬液芯片技术分别测量2型糖尿病性牙周病患者和健康人唾液IL-6含量。结果：2型糖尿病性牙周病患者唾液中IL-6的含量(3.88±0.24)pg/L，健康人唾液IL-6含量(2.78±0.31)pg/L，二者之间有显著性差异(P<0.05)。结论：利用口腔唾液中IL-6的含量评价2型糖尿病性牙周病患者的严重程度是可行的。

糖尿病性牙周病；唾液；白细胞介素6(IL-6)；Bio-Plex；悬液芯片技术

糖尿病是一种严重威胁人类健康的内分泌系统疾病[1]。近年来随着人们生活质量的提高和餐饮质量的变化，2型糖尿病患者的发病率也逐年增加。研究发现[2]，近5年来其发病率由占全国慢性病第7位上升到第3为。牙周病是口腔科常见疾病之一，在我国人群的患病率较高[3,4]。它是一类牙齿支持组织的慢性炎症性疾病，多发生于牙龈、牙周膜等部位。牙周病被认为是糖尿病的第六大并发症[5]，炎症被认为是糖尿病的危险因子，可影响胰岛素抵抗和代谢控制，通过生活方式或治疗降低炎症水平可降低糖尿病进一步发展的风险性[6]。白细胞介素6(IL-6)是主要炎症介质，它在唾液和龈沟液中的浓度是牙周病及糖尿病的活动性指标，与治疗有着密切的关系。本次研究拟对糖尿病性牙周病患者和健康人唾液中IL-6含量进行测定，探讨两组研究对象中唾液中IL-6含量变化规律以及与糖尿病性牙周病发生的关联性。

1 材料与方法

1.1 主要材料

微珠(240μL 25×stock beads加入5760μL Bio-Plex Assay Buffer)，检测抗体(60μL 50×Stock Detection Antibody加入2940μL Detection Antibody Diluent A)和Streptavidin-PE 荧光色素(60μL 100×Streptavidin-PE加入5940μL Bio-Plex Assay Buffer)。

1.2 实验分组及样本采集

通过筛查居民健康档案，分别选择2型糖尿病性牙周病人和健康人各40例作为实验组和对照组。实验组纳入标准：2糖尿病性牙周病患者符合临床诊断标准，无糖尿病并发症，妇女未处于怀孕期及哺乳期；半年内未做过牙周基础治疗；最近3个月未服用过抗生素；全口无龋者；无抽烟者。对照组纳入标准：全身无系统性疾病；妇女未处于怀孕期及哺乳期；半年内未做过牙周基础治疗；最近3个月未服用过抗生素；全口无龋者；无抽烟者。与实验组和对照组参与者签订知情同意书，符合医学伦理学要求。

采样前夜采用Bass法刷牙，次日上午8时清醒空腹情况下进行标本采集。唾液采集采用经典的非刺激性全唾液采集法，每人采集唾液99μL，加入保护液1μL，干冰保温盒中保存。待样本采集完毕，冰浴解冻。

1.3 实验方法

实验流程按照Bio-Plex pro assay说明书进行。

(1)打开Bio-Plex System系统并校正。真空吸板机的真空度调节为1～2Hg压力，用96孔板盖住。(2)将标准品稀释后加入96孔板中，然后加入微珠。轻轻盖上封板膜和铝簿，使每个小孔完全遮住。室温下以1100r/s下振动30s，再以600转/秒下振动30min。(3)振动结束后，以100μL Bio-Plex Assay Buffer润湿滤板，轻轻打开封板膜和铝簿，用100μL Bio-Plex wash buffer 洗2次，吸去buffer，使之完全吸净以防止交叉污染。(4)每孔加入50μL标准品，轻轻盖上封板膜和铝薄，使每个小孔完全遮住。室温下以1100r/s下振动30s，再以600r/s下振动30min。然后将封板膜和铝薄打开，过程中要避免溅出，真空抽去buffer，再100μL Bio-Plex wash buffer 洗2次，吸去buffer，使之完全吸净以防止交叉污染。(5)漩涡振动检测抗体数秒，每孔加入detection antibodies25μL，轻轻盖上封板膜和铝簿，使每个小孔完全遮住。室温下以1100r/s下振动30s，再以600r/s下振动30min。然后将封板膜和铝薄打开，过程中要避免溅出，真空抽去buffer，再100μL Bio-Plex wash buffer 洗2次，吸去buffer，使之完全吸净以防止交叉污染。(6)漩涡混合Streptavidin-PE 荧光色素，每孔加入50μL，轻轻盖上封板膜和铝簿，使每个小孔完全遮住。室温下以1100r/s下振动30s，再以600r/s下振动30min。然后将封板膜和铝薄打开，过程中要避免溅出，真空抽去buffer，再100μL Bio-Plex wash buffer 洗2次，吸去buffer，使之完全吸净以防止交叉污染。(7) 每孔加入125μL Bio-Plex assay buffer 微珠重悬，轻轻用密封袋盖住，1100转室温摇床30秒后立即放入仪器中进行读盘检测。

1.4 统计学方法

采用SPSS20.0软件进行统计学分析，将数据输入该软件，计量资料以均数±标准差来表示，认为P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

实验组与对照组中唾液中IL-6含量，两组之间的差异有统计学意义(P<0.05)。患者唾液中的IL-6含量与糖尿病性牙周病患者有一定的关联。见表1。

表1 实验组、对照组唾液中IL-6含量

3 讨论

人体是一个统一整体，任何一种疾病的发生都不是单一的组织器官的反应，在全身均有反应。唾液是口腔中特殊的微环境，它在口腔中作为液相自成一体，由口腔附近各类大小唾液腺的分泌液和龈沟液混合而成，其内混悬有食物碎片、微生物和口腔上皮脱落细胞。牙周病使得唾液中的细菌，特别是牙周袋深部的致病菌、厌氧菌获得更多的营养物质，在充足营养物质供给的情况下，会使得细菌大量繁殖，导致牙龈组织中小血管基底膜增厚，减少局部供血及供氧，降低了局部的氧分压，使得牙周袋内的厌氧环境进一步增强，使得致病菌大量繁殖。大量细菌繁殖的结果是局部炎症加重，作为主要炎症介质的白细胞介素6(IL-6)的生成大量增加。生成的白细胞介素6一部分通过血液循环进入到机体各部，一部分在牙周组织附近起作用，大幅度提高机体内白细胞介素6的水平，进而导致β细胞的功能和形态发生改变，影响胰岛素的分泌，同时引起胰岛素抵抗增强。由于减少了自身胰岛素的分泌和胰岛素抵抗的增强，使得机体内的糖代谢的影响进一步加剧。唾液中糖含量增加，局部炎症加剧，主要炎症介质白细胞介素6含量进一步增加。这与实验结果相一致。

由于牙周组织的炎症，使得牙周组织的通透性增加大量形成的白细胞介素6可以轻易通过牙周膜与牙槽相接触，与通过血液循环聚集在牙槽骨中的白细胞介素6聚集，进一步增加牙槽骨中的浓度，而白细胞介素6又具有诱导破骨细胞生成的作用使得牙槽骨溶解，牙周袋加深，局部炎症加重，生成更多的白细胞介素6。

Bio-Plex 悬液芯片技术是由最初的微球技术逐渐发展演变而来的，近年来为人类基因重组以及多种多样的蛋白质组提供的一项新技术[7]。它整合了多种实验技术并联合运用计算机运算法则，其强大的分析能力优于传统的ELISA技术，具有更加精准灵敏和宽广的领域[8]。在当今和未来的基因工程测序中占有重要地位，也将成为临床医学诊断中发挥重要作用。

尽管本研究得出II型糖尿病性牙周病患者唾液中IL-6的含量显著高于健康人群，但IL-6在2型糖尿病性牙周病患者胰腺、唾液腺以及牙周组织中的动态变化和相关联动机制尚不清楚，有待于进一步研究。

[1]王瑾堃,刘中柱.尿L-FABP与LAP对2型糖尿病肾病早期诊断的意义[J].黑龙江医药科学,2016,39(4):138-139

[2]樊蕾,杨玉芝.2型糖尿病合并慢性淋巴细胞性甲状腺炎对胰岛素抵抗及冠心病的影响[J].黑龙江医药科学,2014,37(6):85-87

[3]李云霞.牙周病的病因及临床治疗研究进展[J].河北医学, 2013, 19(3):166

[4]杨斯惠,钟良军.TH17细胞与牙周病相关性研究进展[J].口腔医学研究,2013, 29(1):92

[5]Taylor G W, Borgnakke W S. Periodontal disease： Associations with diabetes, glycemic control and complications[J]. Oral Dis，2008，14(3)：191-203

[6]Lalla E， Papapanou P N. Diabetes mellitus and periodontitis: a tale of two common interrelated diseases[J]. Nat Rev Endocrinol，2011,7(12):738-748

[7]刘天龙,王燕飞,邹明强,等.悬液芯片系统在检测领域的研究进展[J].中国畜牧兽医,2011,38(2): 84-87

[8]林田心，黄慧姝.开发利用于Bio-Plex悬液芯片系统抗IL-17A的单克隆抗体[J].生物技术世界,2013,4(3):16

Highlights: Objective: Detection the content of interleukin 6 (IL-6) in oral saliva of patients with type II diabetes mellitus. Method: Determine the content of the IL-6 in saliva of patients with type II diabetes and periodontal disease was measured by Bio-Plex suspension chip technique. Result :The content of IL-6 in saliva of patients with type II diabetes mellitus was (3.88±0.24)pg/L, and the content of IL-6 in saliva of healthy people was about (2.78±0.31)pg/L, so there was significant difference between the two groups (P<0.05). Conclusion: it is feasible to evaluate the severity of patients with type II diabetes mellitus by using the content of IL-6 in oral saliva.

Type 2 diabetic patients with periodontal disease determination content of interleukin 6 in saliva

LIULu-bin,ZHAOYu-zhong,SUNQi-fei,ZHAOLiang

(Stomatology Hospital Affiliated to Jiamusi University，Jiamusi 154002，China)

diabetes mellitus;saliva;interleukin 6 (IL-6);Bio-Plex suspension chip technique

黑龙江省卫生厅课题，编号：2012-231。

刘陆滨(1971～)男，黑龙江佳木斯人，学士，副教授，主任医师。

孙启菲(1987～)女，山东泰安人，在读硕士研究生。E-mail：805038871@qq.com。

R587.1

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1008-0104(2017)04-0011-02

2017-03-13)