果蝇幼虫的甘油三酯和蛋白的测定方法①

陈洁茹， 陈晓伟，杨利敏,3

(1.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯154007；2.北京大学分子研究所，北京100871；3.大连大学医学院，辽宁 大连 116600 )

果蝇幼虫的甘油三酯和蛋白的测定方法①

陈洁茹1， 陈晓伟2，杨利敏1,3

(1.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯154007；2.北京大学分子研究所，北京100871；3.大连大学医学院，辽宁 大连 116600 )

目的：了解果蝇三龄幼虫甘油三酯和蛋白质的提取方法和操作的注意事项。方法：选取同时间段收集的WT1118果蝇三龄幼虫雌雄各10只，以自制裂解液PBST进行裂解研磨。取材后，利用甘油三酯测定试剂盒(冻干粉型)GPO-PAP法和BCA蛋白质测定试剂盒，测量果蝇幼虫体内甘油三酯和蛋白质含量，对雌雄幼虫的甘油三酯和蛋白质含量进行分析。结果：发现雌性幼虫体内，无论是甘油三酯或蛋白质含量都高于雄性幼虫。结论：以果蝇三龄雌性幼虫各10只为例，雌性幼虫的甘油三酯和蛋白含量均高于雄性幼虫。

果蝇幼虫；提取方法；甘油三酯和蛋白质测试盒测定法；注意事项

果蝇(Drosophila)是生物科学实验研究中不可缺少的模型，作为经典的模式生物，本身具有自身特异的优势。首先，它的生长周期快，在25℃条件下，大约10～14d可繁殖一代至成虫[1,2]。所以，为相同条件下，同时期收集同等大小及数量相同的虫卵提供了条件。其次，果蝇培养基的制作方法已经成熟，可根据不同实验条件而改变，在此所述为果蝇基础培养基的制法：例如制作200mL培养基，(1)琼脂：3g(2)酵母：16g(3)玉米面：15g(4)葡萄糖：4g(5)加灭菌的超纯水或三蒸水补齐，溶质溶剂共200mL。

1 材料与方法

1.1 实验对象、试剂盒及仪器

野生果蝇WT1118(来自北京大学生命科学院饶毅实验室)，甘油三酯测定试剂盒(北京普利莱公司)，BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo科学公司)，恒温水浴箱(保恒恒温技术有限公司)、普通光学显微镜(BH-Z日本Olympus公司)。幼虫和成虫均可按以下方法对甘油三酯和蛋白质进行提取，但成虫身体成分和杂质较多，对于测量结果易产生影响，所以以下实验未涉及果蝇成虫的提取。

1.2 实验步骤

(1)果蝇杂交的设计：首先收集25只未交配的WT1118成虫处女蝇，同15只成虫雄性果蝇放于同一培养瓶中，放于培养箱中饲养，使它们交配完全。

(2)收集虫卵：3d后，于中午12时，将全部果蝇转移到新的培养瓶中，收集时间为2h(研究表明果蝇每天12～16时内，产卵率偏高)，保证虫卵在一个发育时期。

(3)三龄幼虫雌雄分装：将收集两小时虫卵的培养瓶置于培养箱，3d后，当幼虫生长到三龄期，用钩针或钝头镊子将虫卵移置装有灭过的PBS溶液或超纯水中，在显微镜下区分雌雄，雌性各10只，用1.5mL EP管分装，注明样品名称(由于三龄期幼虫会在培养基内爬行，虫体会沾有培养基，会影响测量结果，可在分装前，可用超纯水清洗虫卵3次，后用无尘纸将虫卵表面的水分吸干)。(4)贮存方法：入管后立即放入事先准备好的液氮中，冻存于-80℃冰箱(液氮和低温冻存是为了保证幼虫样本体液不失活)。

1.3 裂解液的配置

通过查阅文献，可以自制研磨虫体的裂解液PBST(PBS+0.05%Tween20，二者比例4:1)[3，4]，配置好后，通过滤膜过滤杂质，将裂解液放于4℃冰箱贮存。

2 试剂盒测定原理

2.1 甘油三脂(TG)诊断试剂盒

对于冻干粉型甘油三酯测试盒，实验原理如下：1)甘油三脂+水在脂肪酶催化下生成甘油+脂肪酸 2)甘油+ATP在甘油激酶的作用在生成甘油-3-磷酸+ADP 3)甘油-3-磷酸+氧气在甘油磷酸氧化酶催化下生成磷酸二羟丙酮过氧化物酶+双氧水 4)双氧水+4-氨基安替比林+对氯苯酚在过氧化物酶作用下生成醌染料+水+氯化氢，醌染料在波长500nm有最大光吸收，颜色的强度与血清中甘油三酯含量成正比。

反应液可按照说明书进行配置，一般条件是向干粉瓶中加入10mL R1原液，室温手动匀速摇瓶10min即可。标准品用所配置的PBST裂解液按照1:4的比例进行稀释，单独用EP管进行分装，以免对原装校准品造成污染，结束后立即放入4℃贮存。

2.2 BCA蛋白浓度测定试剂盒

BCA法是应用较广的测定蛋白质浓度的方法。原理为双缩脲反应，即在碱性环境下蛋白质将二价酮离子还原成一价酮离子，产生一种紫蓝色复合物，这种复合物在一定波长处有较高的吸光值，同时反应产物量与蛋白质的浓度成正比。试剂盒中所提供的蛋白标准品(BSA)为实验者设置标准曲线提供了便捷。试剂盒可室温保存，但蛋白标准品(BSA)需负20℃保存。

2.3 配制蛋白标准品和工作液

(1)配制BSA标准液：1)向30mg BSA标准品中加入1mL蛋白标准品配制液，充分溶解后配制成30mg/mL的蛋白标准母液，配置后应立即稀释使用。2)取适量浓度为30mg/mL的蛋白标准母液，稀释至终浓度为2mg/mL。标准品稀释液为蛋白样品的裂解液，原则上是：蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用该溶液稀释(也可用0.9%的Nacl或PBS溶液进行稀释)。

(2)配制BCA工作液：1)计算实验中所需要的BCA工作液总体积公式：BCA工作液总体积=(标准品+待测样品)×重复数×每个样品所需要的BCA工作液。2)配制BCA工作液：在50体积的BCA试剂A中加入1体积的BCA试剂B(比例为A:B=50:1)，使其充分混匀。BCA试剂B加入BCA试剂A中后，立即浑浊，摇匀后则立即变澄清。

3 提取方法

待一切准备就绪，正式开始实验前，预冷4℃离心机，准备好足够冰盒、冰袋或者铝块(铝块传导温度快)，将负80℃样本取出，用长镊子夹住EP管，置于铝块或冰上。

(1)加入200μL事先配制的裂解液进行匀速研磨，尽量降低研磨过程中摩擦产热，研磨速度为10次/分(研磨器可使用成品，需事先将研磨棒进行灭菌，一种样本用一根，切勿混淆；若没有成品研磨器，可用干净的1000μL枪头制作简易的研磨棒。用酒精灯灼烧枪头尖部，塑料制品遇火融化，枪头融为闭塞状，可用1.5mL EP管测试与管底契合程度，按照实验需求制作，灭菌备用)。所有的研磨都要在冰上进行，防止样本降解。

(2)待裂解样本溶液呈均匀浑浊样，于4℃离心机瞬离30秒，将管壁上残留的样品溶液轻轻弹下，后置于冰上。将离心好的样品溶液，取出100μL上清液到另一个1.5mL EP管后置于冰上或负80℃贮存，待测甘油三酯；剩余100μL用来测定蛋白含量(鉴于蛋白成分易受温度影响，建议先做蛋白浓度测定)。

4 甘油三酯和蛋白质浓度测量

4.1 甘油三酯的测定

将用于测定甘油三酯的100μL样本的EP管，置于70℃水浴锅煮10min。待到时间，按照下列表格(表1)加好样品，37℃水浴锅加热30min后加样。

表1 甘油三脂加样表

很多甘油三酯测试盒说明上都以水为背景作为空白对照组，但考虑到果蝇无血液且数据的严密，所以将裂解液作为背景。30min后，取出用指腹轻弹管壁，充分混匀。按照上述列表顺序加样，尽量减少加样产生的气泡；如果为了测量的准确，可同一种样本分别三次加样，取平均值。根据说明书要求的波长进行设置，完毕后进行读取数据进行分析。

计算公式：

图1 WT1118雌性与雄性幼虫甘油三酯含量

4.2 蛋白质浓度测定

将用于测定的蛋白的100μL样品溶液4℃ 12000rpm离心10min，吸取BSA反应液于酶标板，定好点样图，做好标记。吸取离心后样品上清溶液(上样量根据预实验在标准曲线可测范围显色而定于反应液。设置标准曲线6个点，分别是0、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0(mg/mL),加5μL标准品溶液于反应。将盛有混合液的酶标板置于37℃水浴10min后取出放于室温。然后微孔板加样，加样方法如下：1)各取25μL标准品和待测样品加入到微孔板中 2)每孔加入200μL BCA工作液，振荡30秒充分混匀，37℃放置30min 3)冷却到室温，在酶标仪上的562nm波长处检测吸光度 4)根据BSA标准品的吸光度，绘制标准曲线。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。置于酶标仪测定，记录分析。见图2。

图2 WT1118 雌性与雄性幼虫蛋白含量

使用BCA蛋白测定法测量时，颜色会随着时间延长而不断加深，且显色反应的速度和温度相关，所以在实验过程中需注意保持定时和定温，以确保定量精确。每次测定时，都需重新做相应的标准曲线。

5 讨论

根据以上两项结果显示：雌性果蝇三龄幼虫体内甘油三脂和蛋白含量均高于雄性幼虫，这与雌性幼虫体内雌激素有关。希望通过本实验的提取方法和操作步骤为日后其他人对果蝇的实验和学习提供技术支持与帮助[5,6]，本人的提取方法和实验操作尚有不足，我会在日后的实践操作中继续探索解决实验的瑕疵之处，努力提高实验技术水平。

[1]饶友生,柴学文,王障凤.果蝇—打开生命科学之门的金钥匙[J].生物学通报,2008,43(12):8-10

[2]万永奇,谢 维.生命科学与人类疾病研究的重要模型——果蝇[J].生命科学，2006,(5):425-429

[3]Justin R，DiAngelo and Morris J. Birnbaum.Regulation of Fat Cell Mass by Insulin in Drosophila melanogaster[J].Molecular and Cellular Biology,2009,6341-6352

[4]Laura Palanker,Musselman, Jill L Fink,et al.Baranski.A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type Drosophila[J].Disease Models & Mechanisms，2011，4：842-849

[5]王桂梅,王彩霞.CBL教学法在临床病理学教学中的实践和探索[J].黑龙江医药科学,2016, 39(2):50-51

[6]栾倩,刘蕾.灵芝酸对痫样放电海马神经元2磷酸化ERK1/2水平的影响[J].黑龙江医药科学,2014,37(2):1-3

国家自然科学基金项目,编号：31571087和31200839。

陈洁茹(1989～)女，黑龙江双鸭山人，在读硕士研究生。

杨利敏(1973～)女，黑龙江佳木斯人，博士，教授，硕士研究生导师。E-mail：lmyang@jmsu.edu.cn。

R392；R446.5

A

1008-0104(2017)04-0003-02

2017-04-15)