一株光合细菌的分离与鉴定

2017-08-30林启存朱丽敏沈小红蔡丽娟戴瑜来冯晓宇

浙江农业科学 2017年8期

关键词：培养液水样生理

林启存，朱丽敏，沈小红，蔡丽娟，戴瑜来，冯晓宇

(1.杭州市农业科学研究院水产研究所，浙江杭州 310024； 2.杭州市市区河道监管中心，浙江杭州 310006)

一株光合细菌的分离与鉴定

林启存1，朱丽敏1，沈小红2，蔡丽娟1，戴瑜来1，冯晓宇1

(1.杭州市农业科学研究院水产研究所，浙江杭州 310024； 2.杭州市市区河道监管中心，浙江杭州 310006)

通过富集、纯化等方法，从杭州甲鱼养殖水体中分离到一株光合细菌(PSB-1)，经形态学观察，生理生化特性和16SrRNA基因序列分析，初步确定分离株菌PSB-1为沙氏外硫红螺菌。

养殖水体；光合细菌；生理生化； 16SrRNA基因

光合细菌(photosynthetic bacteria，简称PSB)是一类以光作为能源，能在厌氧光照或好氧黑暗条件下利用自然界中的有机物、硫化物、氨等作为供氢体兼碳源进行光合作用的微生物，具有固氮、固碳、降解亚硝酸盐、脱氢、氧化硫化物等不同种生理生化功能，在自然界的碳、氮、硫循环中发挥着重要作用[1]。

光合细菌用于养殖水处理已非常普遍，且使用方式以全池泼洒菌制剂为主。菌种是微生态制剂处理水质的核心关键，由于光合细菌种类多、生理功能多样，加上不同菌株对水体的适应能力或对污水的处理能力存在较大差异[2]，因此从天然水体中挖掘高活性菌株仍是当前光合细菌的重要研究方向[3-5]。

本研究从甲鱼养殖水体富集分离筛选出一株光合细菌，对其进行形态学、生理生化和16SrRNA基因序列分析，为该菌株的进一步应用研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 富集用样品

富集用水样采自杭州市西湖区双浦镇某外塘甲鱼养殖场。

1.1.2 培养基

富集培养基。CH3COONa 2 g·L-1+CH3CH2COONa 0.2 g·L-1+NaCl 0.5 g·L-1+NH4Cl 1 g·L-1+MgCl20.1 g·L-1+NaHCO31 g·L-1+K2HPO40.1 g·L-1+CaCl20.01 g·L-1+酵母膏0.05 g·L-1+C2H5OH 0.1 mL·L-1，用磷酸液将pH值调至7.0。

分离纯化培养基。富集培养基中加入15 g·L-1的琼脂制成固体培养基分装于培养皿中。

1.2 富集与分离

取滤网除杂的水样1 mL于18 mm×180 mm试管中，加经灭菌处理的富集培养基至15 mL，混匀，倒入灭菌液状石蜡封口，并塞上橡胶塞，置(30±1)℃、2 000 lx左右恒温光照培养箱中2～3周。待液体培养物呈红色或红棕色时，吸取1 mL培养液，转接至另一装有新鲜培养液的试管中，重复上述操作4～5次，使目标菌占优势生长。

采用平板划线法在经灭菌处理的光合细菌纯化培养基上接种细菌。将接种后的培养皿放入装有厌氧产气袋的透明培养袋中，密封袋口后倒置培养5～7 d，温度控制在(30±1)℃、光照强度在2 000 lx左右。待菌落生长起来，挑选红色或红棕色单菌落反复操作2～3次，直至获得较纯的单菌落。

1.3 分离菌株的扩培与初筛选

用无菌蒸馏水浸洗纯化的菌落，取1 mL菌洗液加到装有液体培养基18 mm×180 mm试管中，参照富集方法培养至深色，然后取培养液以体积比1∶4的比例接种到装有富集培养基的250 mL塑料瓶中，密封瓶口，并置恒温光照下培养7～10 d，至颜色呈深色、D660≥1.5备用。

取培养液接种处理鱼塘水样，分别测定水样处理前后的COD值、铵氮、亚硝酸盐氮和总氮，计算其去除率，比较处理效果，筛选净化效果相对好的菌株。

COD采用重铬酸钾分光光度法测定；铵氮采用纳氏试剂分光光度法测定；亚硝酸氮采N-1-萘基-乙二胺光度法测定；硝酸氮采用酚二磺酸紫外分光光度法测定；总氮采用过硫酸钾氧化紫外分光光度法测定。

1.4 分离菌株的鉴定

1.4.1 菌体形态观察

对分离的菌体在载玻片上涂片和革兰氏染色处理，显微镜下观察菌体形态。

1.4.2 分离菌株生理生化特性分析

参照《常见细菌系统鉴定手册》文献[6]对分离菌株进行生理生化特性鉴定，包括接触酶、氢化酶、明胶液化、乙酸钠、丙酸钠、乳酸钠、硫代硫酸钠、柠檬酸钠、乙醇、甘油、苯甲酸钠等试验。

1.4.3 16SrDNA序列分析

采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(SK8255)提取该菌株的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用细菌通用引物对(正向引物fD1：5′-cagagtttgatcctggct-3′，反向引物rp2：5′-aggaggtgatccagccgca-3′)进行16SrDNA PCR扩增。PCR扩增反应体系：10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，模板DNA 0.5 μL，引物各0.5 μL，Taq酶0.2 μL，加双蒸水至25 μL。扩增条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s，55 ℃ 4复性5 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃修复延伸10 min，4 ℃终止反应。

PCR扩增产物经1%琼脂糖电泳检测，交由上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。测序结果在NCBI上blast比对。

2 结果与分析

2.1 光合细菌的富集分离

经4次富集和2次纯化分离，从水样中得到菌落形态相似(湿润圆形略隆起、边缘整齐、有光泽)，但颜色、大小不相同的2株细菌(编号为PSB-1、PSB-2)，PSB-1菌落为红色、直径0.5～2.0 mm，PSB-2菌落为淡红色、直径0.2～1.0 mm。

2.2 分离菌株的初筛选

以PSB-1、PSB-2为菌株进行液体扩大培养，按30%的比例接种母液，培养7～10 d，培养条件同上，至颜色呈深色。取菌液接种处理鱼塘水样，分别测定水样处理前后的COD值、铵氮、亚硝酸盐氮和总氮，计算其去除率，比较处理效果，筛选净化效果好的菌株。

以截去瓶口的5 L塑料油瓶为试验容器，每瓶取鱼塘水3 kg，初始水样COD、总氮、铵氮、亚硝酸氮分别为61.00、4.83、1.46、0.43 mg·L-1。于25～30 ℃环境温度条件下，试验组每瓶放PSB-1或PSB-2菌液，对照组不放任何菌液，试验周期5 d。试验末取各组水样测定水质，其结果及去除率见表1。

表1 2种菌株培养液对养殖水质的影响

从表1中可看出，PSB-1菌液对水样COD、总氮、铵氮、亚硝酸氮的去除效果均比PSB-2菌液好，因此选PSB-1为对象进行下一步研究。

2.3 光合细菌菌株PSB-1鉴定

2.3.1 菌株PSB-1的菌体形态观察

经革兰氏染色后镜检结果显示，菌株PSB-1呈阴性短杆菌，菌体大小为(1.6～2.0)μm×(0.8～0.9) μm。

2.3.2 生理生化特性

由表2可看出，分离菌株接触酶试验、氢化酶试验为阳性；明胶液化试验为阴性；可利用乙酸钠、丙酸钠、乳酸钠、硫代硫酸钠、柠檬酸钠、乙醇、甘油，不能利用苯甲酸钠、酒石酸钾钠。

2.3.3 分离菌株16SrRNA基因序列分析

分离菌株扩增出的 16SrDNA片段条带单一，测序后得到长度为1486 bp16SrRNA基因序列：

表2 分离菌株PSB-1的生理生化特性

注：+表示利用，-表示不利用。

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