分子印迹技术在茶叶中的应用

2017-08-30高士伟王雪萍王胜鹏郑鹏程刘盼盼龚自明

浙江农业科学 2017年8期

关键词：印迹儿茶素咖啡因

郑琳，高士伟，曹丹，王雪萍，王胜鹏，叶飞，郑鹏程，滕靖，刘盼盼，龚自明

(湖北省农业科学院果树茶叶研究所，湖北武汉 430064)

分子印迹技术在茶叶中的应用

郑琳，高士伟，曹丹，王雪萍，王胜鹏，叶飞，郑鹏程，滕靖，刘盼盼，龚自明*

(湖北省农业科学院果树茶叶研究所，湖北武汉 430064)

分子印迹技术是一项制备与识别“分子钥匙”的人工“锁”技术，在分离提纯、免疫分析、模拟酶、催化以及生物传感器等方面的应用研究有较广阔的空间。本文对分子印迹技术在提取纯化茶叶中咖啡因、儿茶素、EGCG单体等有效成分中的应用现状进行了综述，并分析了应用前景，以期为分子印迹技术与茶叶深加工技术的进一步“合作”开拓思路。

分子印迹技术；茶叶；应用现状；前景分析

分子印迹技术(Molecular Imprinting Technology，简称MIT)是以目标分子为模板，制备对该目标化合物具有特异选择性的聚合物的过程。茶叶作为中国特有的饮品，选育品种多样，种植历史悠久，针对其所含茶碱、茶多酚、儿茶素、茶黄素、EGCG等成分的功效性分析研究层出不穷。本文对分子印迹技术在茶叶成分提纯中的应用现状进行了概述，旨在为提高茶叶深加工产品的品质和产量、高效快速判定茶叶安全性等提供思路。

1 分子印迹聚合物的制备

分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymers，简称MIP)的制备过程分三步：1)在一定溶剂(也称致孔剂)中，模板分子与功能单体依靠官能团之间的共价或非共价作用形成主客体配合物；2)加入交联剂，通过引发剂、光或热等引发单体聚合，使主客体配合物与交联剂通过自由基共聚合在模板分子周围形成高联的刚性聚合物；3)选用合适的溶剂，物理或者化学方法将聚合物中的印迹分子洗脱或解离出来。这样在聚合物中便留下了与模板分子大小和形状相匹配的立体孔穴，同时孔穴中包含了精确排列的与模板分子官能团互补的由功能单体提供的功能基团，如果构建合适，这种分子印迹聚合物就像锁一样对此钥匙具有选择性，所以分子印迹技术通常也被描述为制备与识别“分子钥匙”的人工“锁”技术。所得分子印迹聚合物包括絮块状、线状、棒状、微球、凝胶、薄膜等形态，其制备方法主要有本体聚合法、悬浮聚合法、分散聚合法、沉淀聚合法及表面印迹法，各有千秋，详见表1。

2 分子印迹技术在茶叶成分提纯中的应用现状

早在1973年，Wulff等[1]研究以乙烯基苯基硼酸和4-硝基苯基-α-D-甘露糖苷反应，得到模板分子，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯和甲基丙烯酸甲酯后共同聚合，然后通过硼酸酯分解除去模板，首次成功制得共价型分子印迹聚合物，使分子印迹方面的研究产生了突破性进展。随着80年代非共价模板聚合物的出现，Mosbach等[2]认为，单体和模板间存在非共价相互作用，也能达到印迹目的，成功用非共价型分子印迹聚合物分离得到茶碱以后，分子印迹技术在分离提纯、免疫分析、模拟酶、催化以及生物传感器等方面的应用研究如雨后春笋般盛起。

受品种、生长环境、加工方式不同等影响，茶叶中活性成分结构复杂、类型多样。目前，茶叶中有效成分的分离纯化主要依赖于硅胶柱色谱、大孔吸附树脂柱色谱、聚酰胺柱色谱、凝胶柱色谱、高速逆流色谱、制备型高效液相色谱等色谱技术，以EGCG的分离纯化为例，为了得到高纯度EGCG单体，生产中常使用氯仿、乙酸乙酯等有毒试剂，也大量使用到乙醇等有机溶剂，或需经反复柱色谱纯化，不仅溶剂消耗量大、环境污染严重，而且效率和收率也低。与上述色谱分离技术相比，分子印迹技术显示出独有的优点：构效预定性、操作稳定性、广泛实用性、抗物理撞击和耐酸、碱、热等特点，同时操作简单，溶剂消耗量小，模板和MIPs都可以回收再利用。正因如此，2000年开始分子印迹技术也被广泛用于茶叶深加工行业，用来分离纯化茶叶中的有效成分。

表1 MIPs制备方法及其优缺点

2.1 在分析/提纯咖啡碱成分中的应用

早在2000年，Kobayashi等[3]就以咖啡因为模板、聚丙烯腈为聚合剂，采用沉淀聚合法制备出咖啡因MIPs膜，再将厚约0.1mm的膜贴在石英晶体的金电极上，制成MIPs-QCM传感器，只需将传感器浸入含咖啡因的样品液中，根据电极数据反应即可清楚所得咖啡因含量。Mohammed等[4]在此基础上制作了更加精细的咖啡因MIPs-QCM传感器，可定量分析茶样中咖啡因的含量，相对标准偏差保证在±5%。Theodoridis等[5]以热聚合法制备了咖啡因MIPs，并证实该MIPs固相萃取剂可从茶叶饮料中直接萃取咖啡因。颜流水等[6]同样以咖啡因为模板、聚丙烯腈为聚合剂，紫外光引发原位聚合，制备出咖啡因MIPs毛细管整体柱，可从绿茶饮料中有效分析出咖啡因含量。

2.2 在提纯/检测儿茶素成分中的应用

诸多研究用分子印迹技术从茶叶中提取纯化得到咖啡因，或者可有效检测茶饮品中咖啡因的含量，受其启发，一众研究学者开展了儿茶素印迹分子聚合物的制备及应用研究。雷启福等[7]制备了儿茶素MIPs，并将此MIPs作为固相萃取剂，从茶叶提取物中分离富集儿茶素，效果较好。干宁等[8]先选用EC为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，乙烯二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，偶氮二异丁腈为引发剂，紫外诱发合成聚合物EC-MIPs；再用EC-MIPs填充制备EC-MIPs-SPE柱，萃取分离茶叶样品；最后采用电喷雾质谱(EIMS)检测洗脱液中儿茶素含量，结果显示，该方法有效去除94.2%的咖啡因和全部茶碱干扰，可用于茶叶中微量儿茶素分离鉴定。刘伯洋等[9]建立了一种分子印迹固相萃取-毛细管电泳联用检测表儿茶素的方法：首先考察了模板分子(表儿茶素)、功能单体(丙烯酰胺)、交联剂(乙二醇二甲基丙烯酸酯)和引发剂(偶氮二异丁腈)在不同比例条件下表儿茶素分子印迹聚合物的特异性吸附能力，并利用扫描电子显微镜和红外光谱技术对聚合物进行表征，然后在毛细管电泳条件下对加载过固相萃取柱的过柱液与洗脱液进行检测，结果表明，该方法可靠有效。

2.3 在提纯EGCG单体成分中的应用

钟世安等[10]选用模板分子EGCG，功能单体α-甲基丙烯酸，交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯，光冷条件下引发合成EGCG分子印迹聚合物，并将该聚合物用于固相萃取茶叶提取物茶多酚，结果显示，所得EGCG纯度可达92.4%。随后，张春静等[11]以多孔乙酸纤维膜为支撑体，成功制备了EGCG分子印迹复合膜，可从茶多酚中分离富集得到纯度为93%的EGCG单体。张文博等[12-14]先后研究制备EGCG分子印迹壳聚糖膜，优化其工艺及性能，结果表明，该膜可有效分离茶叶中EGCG单体，并可有效应用于电化学传感方面。秦宇[15]以光或热为引发条件，制备了EGCG-微/纳米硅胶分子印迹聚合物及EGCG-分子印迹复合膜，联合傅里叶变换红外光谱、扫描电子显微镜和元素分析等对其进行表征，并从静态、动态和选择性吸附多重方向评价其吸附性能，结果显示，聚合物表征和吸附性能均良好。随着分子印迹聚合物制备方法的比较研究，表面分子印迹法显现出绝对优势，结合表面分子印迹法检测分离中药成分的研究颇多，茶叶研究者也与时俱进，将其应用到了对茶叶成分的分离中。徐菲菲等[16]以g-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的硅胶为载体、EGCG为模板分子、甲基丙烯酸为功能单体，用表面分子印迹的方法制备了SMIP，可有效吸附茶叶中的EGCG单体。胡颖[17]制备出EGCG新型表面分子印迹聚合物，以此为固相萃取的吸附剂，分离纯化了茶多酚中的EGCG单体，并识别检测出牙膏样品中痕量EGCG，建立了基于表面分子印迹聚合物-固相萃取-高效液相色谱分析的新方法。

3 展望

我国茶叶有绿茶、红茶、乌龙茶、黄茶、白茶、黑茶，是全球最重要的茶叶大国，茶叶面积第一、茶叶产量第一、出口第三，我国茶叶产销量约占世界的38%。相较于分子印迹技术在中医药行业的高度利用，该技术在茶叶行业的应用研究太少，若能与茶叶深加工、茶叶品质检测等方向的研究有效合作，将是强强联合。

3.1 与茶叶深加工技术的合作前景分析

茶叶深加工技术作为提高茶叶附加值、延伸茶叶产业链的有效手段，近年来产学研机构都投入了相当多的精力和经济开展研究，但是都难有重大突破。膜技术、固相萃取技术、纳米技术等在茶叶深加工发展中应用较多，分子印迹技术若能与之有效联合应用，将可开展提纯甲基化EGCG、r-氨基酸等茶叶微量成分的相关研究，凸显出高选择性、良好稳定性、广泛适用性等特点，增加茶叶深加工产品的种类并提高其产量和品质。

3.2 与茶叶品质检测的合作前景分析

随着茶园种植面积的快速增加，茶园土肥药的管理问题出现，还有一些茶企加工不连续不规范，储存运输不专业，导致茶叶品质安全问题日益严峻，分子印迹荧光纳米探针分析高效、灵敏、快速、简便[18]，可有效检测出茶叶中的农药及有害微生物残留，保证茶叶品质安全，为茶产业的可持续发展保驾护航。

3.3 尚需解决的问题

分子印迹聚合物通常在有机溶剂中合成，但由于极性溶剂破坏了模板分子与单体间的氢键作用，故其识别能力在用于水相中目标物的富集时就会变弱。但是茶叶提取物的提纯大多是在水相中完成的，所以选择适应性强的交联剂、水溶性功能单体等，也是应用中需要解决的问题。

[1] WULFF G. SARHAN A，ZABROCKI K. Enzy-analogue built polymers and their use for the resolution of materials [J].Tet Lett，1973，44：4329-4332.

[2] MAYES A，MOSBACH K. Molecularly imprinted polymer beads:suspension polymerization using a liquid perfluorocabon as the dispersing phase[J]. Analysis Chemistry，1996，68：3769-3774.

[3] KOBAYASHI T，MURAWAKI Y，REDDY P S，et al. Molecular imprinting of caffeine and its recogniti on assay by quartz-crystal microbalance[J].Anal Chim Acta，2001，435：141-149.

[4] MOHAMMED ZOUGAGH，ANGEL RIOS，MIGUEL VALCARCEL. Automatic selective determination of caffeine in coffee and tea samples by using a supported liquid mem brane-modified piezoelectric flow sensor with molecularly imprinted polymer[J].Anal Chim Acta，2005，539：117-124.

[5] THEODORIDIS G，MANESIOTIS X C P. Selective solid-phase extracti on sorbent for caffeine made by molecular imprinting[J].J Chromatogr A，2002，948：163-169.

[6] 颜流水，王宗花，罗国安，等. 分子印迹毛细管整体柱液相色谱法测定咖啡因[J]. 分析化学，2004，32(2)：148-152.

[7] 雷启福，钟世安，向海艳，等. 儿茶素活性成分分子印迹聚合物的分子识别特性及固相萃取研究[J]. 分析化学，2005，33(6)：857-860.

[8] 干宁，李榕生，陈亚东，等. 分子印迹固相萃取和电喷雾质谱法联用测定茶叶中四种儿茶素[J]. 茶叶科学，2009，29(3)：231-235.

[9] 刘伯洋，李利军，程昊，等. 分子印迹固相萃取技术对六堡茶中表儿茶素的分离特性[J]. 食品科学，2017，38(2)：164-169.

[10] 钟世安，贺国文，雷启福，等. 儿茶素活性成分分子印迹聚合物的固相萃取研究[J]. 分析试验室，2007，26(10)：1-4.

[11] 张春静，钟世安. 乙酸纤维-EGCG分子印迹复合膜分离纯化茶多酚中的EGCG[J]. 膜科学与技术，2008，28(5)：100-102，109.

[12] 张文博. EGCG分子印迹聚合物的制备及其性能研究[D]. 福州：福建师范大学，2010.

[13] 蓝华秀. EGCG分子印迹聚合物的制备及在电化学传感方面的应用研究[D]. 福州：福建师范大学，2012.

[14] 陈盛，蓝华秀，马秀玲，等. EGCG分子印迹壳聚糖膜的制备及性能研究[J]. 福建师大学报(自然科学版)，2012，28(5)：67-72.

[15] 秦宇. 基于分子印迹技术分离/富集EGCG及其性能研究[D]. 南京：江苏大学，2012.

[16] 徐菲菲，段玉清，张海晖，等. EGCG-硅胶表面分子印迹聚合物的制备及吸附性能[J]. 过程工程学报，2011，11(4)：706-710.

[17] 胡颖. 表面分子印迹聚合物的制备及其对EGCG的分离检测研究[D]. 杭州：浙江工业大学，2015.