白芨种子萌发形态学观察及组培快繁体系的建立

2017-08-30席刚俊李警保韩正敏

浙江农业科学 2017年8期

关键词：白芨土豆泥种皮

席刚俊，李警保，韩正敏*，史俊，贾君

(1.江苏农林职业技术学院，江苏句容 212400； 2.南京林业大学森林资源与环境学院，江苏南京 210037)

白芨种子萌发形态学观察及组培快繁体系的建立

席刚俊1，李警保2，韩正敏1*，史俊1，贾君1

(1.江苏农林职业技术学院，江苏句容 212400； 2.南京林业大学森林资源与环境学院，江苏南京 210037)

为了建立白芨的组培快繁体系，在实验室条件下，利用显微镜对白芨种子的萌发过程进行了观察，同时针对白芨无菌种子萌发、丛生芽增殖和壮苗生根各阶段，筛选较适宜的培养基类型、激素种类和含量、添加剂种类和用量。结果表明，白芨种子萌发和原球茎发育被划分为5个阶段，以1/2 MS为基础培养基，添加0.5 mg·L-16-BA、0.2 mg·L-1NAA及200 g·L-1土豆泥，萌发率可达83.47%±3.11%；基本培养基中添加10 g·L-1蔗糖、0.5 mg·L-1NAA、75 g·L-1香蕉泥和100 mL·L-1椰子汁，适合白芨幼苗壮苗生根。

白芨；组织培养；萌发率；丛生芽；生根

白芨是兰科白芨属多年生草本植物，是温带地生兰科植物中最具有经济价值的类群之一，其块茎为我国传统名贵的中药，花色艳丽，也是一种很好的景观植物。白芨喜温暖、阴湿的环境，分布较广，主产于贵州、四川、湖南、湖北、安徽、江苏、河南、云南、广西、浙江等省区[1]。白芨鳞茎入药，性平、味苦，民间常将其作为胶黏性止血剂，用于补肺、生肌、祛痰、止血，治疗吐血、肺病、咳血、慢性胃溃疡等[2-3]。白芨中含量较高的白芨胶可以替代阿拉伯胶等胶剂作为混悬剂及乳化剂，可广泛用于食品及化工领域[4-5]。近年来，随着白芨价格的提高，我国大部分地区的野生白芨遭到过度采挖，导致其野生自然资源急剧减少，濒临灭绝，被国家列为重点保护野生药用植物之一，属濒危植物[6]，同时也被列入《濒危野生动植物国际贸易公约》(CITES)保护种类[1]。长期以来，白芨处于就地采收、就地留种、就地栽培这样的简单循环状态。白芨种子发育不完全，在自然条件下很难萌发和生长，一般靠分株繁殖，很难满足大量栽培的需要，通过组培快繁技术可以规模化繁殖白芨种苗，满足白芨规模化种植的需要[7-11]。

本文以白芨种子为材料，观察了白芨种子在萌发过程的形态学变化，同时探讨了不同因素对白芨种子萌发和壮苗生根的影响，初步建立了白芨种苗的组培快繁体系。

1 材料与方法

1.1 材料

成熟未开裂的白芨蒴果，于2014年9月采自四川雅安，2014年10月在江苏农林职业技术学院组培实验室进行组培试验。

1.2 方法

1.2.1 种子萌发形态学观察

将野外采集的蒴果在自来水下冲洗干净，在无菌条件下经75%乙醇浸泡40 s，无菌水冲洗2～3次，2%次氯酸钠溶液浸泡10 min，无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干蒴果表面的水分。将蒴果纵向切开，将种子播种于固体培养基(1/2 MS+蔗糖25 mg·L-1+琼脂6 g·L-1，pH值5.6)，置于温度25 ℃，光照2 500 lx，12 h·d-1，湿度60%～80%的培养箱中培养。

种子萌发情况用显微镜每周观察1次，观察结果参照Stewart等[12]的方法进行分级描述：0，种皮完整，未萌发；1，种胚膨大；2，种胚继续膨大，种皮破裂(萌发)；3，原球茎出现；4，长出第1片子叶；5，出现第2片子叶(幼苗)。

1.2.2 白芨种子萌发

以1/2 MS为基础培养基，添加蔗糖25 g·L-1，琼脂粉6 g·L-1，pH值5.6，NAA(C)、6-BA(B)和土豆泥(A)的添加量采用正交设计L9(34)进行筛选。共9个处理，每个处理5次重复，置于温度25 ℃，光照2 500 lx，12 h·d-1，湿度60%～80%的培养箱中培养。定期观察种子的萌发情况，30 d后统计种子的萌发率。具体1～3水平A分别为0、75、150 g·L-1，B分别为0.5、1.0、1.5 mg·L-1，C分别为0、0.1、0.2 g·L-1。培养基编号1～9处理依次为A1B1C1、A1B2C2、A1B3C3、A2B1C2、A2B2C3、A2B3C1、A3B1C3、A3B2C1、A3B3C2。

1.2.3 壮苗生根培养

当种子萌发形成的幼苗长到1.5 cm以上时，选择长势一致的幼苗转接到不同的生根培养基中培养，每种培养基接种10瓶，每瓶3株幼苗，培养条件同种子萌发，60 d后观察白芨苗生根情况。壮苗生根培养基以1/2 MS+2 g·L-1活性炭为基础培养基，添加不同浓度的蔗糖(A)、NAA(B)、香蕉泥(C)和椰子汁(D)，pH 值5.8±0.2，进行正交L9(34)试验。1～3水平A分别为10、20、30 g·L-1，B分别为0、0.5、1.0 mg·L-1，C分别为0、75、150 g·L-1，D分别为0、100、200 mL·L-1。具体培养基编号1～9处理依次为A1B1C1D1、A1B2C2D2、A1B3C3D3、A2B1C2D3、A2B2C3D1、A2B3C1D2、A3B1C3D2、A3B2C1D1、A3B3C2D3。

2 结果与分析

2.1 白芨种子结构与萌发过程

成熟的白芨蒴果呈圆柱形或镰刀型，内包含数万粒微如尘埃(或面粉)的种子。白芨种子在成熟的过程中先形成种皮，再发育成胚。显微观察发现，部分种子只有种皮没有胚(图1中A、B)。

A，种子的结构；B，有胚种子和无胚种子；C，胚轴生长；D，种子种皮完整，未萌发；E，种胚膨大变绿；F，种胚继续膨大，种皮破裂(萌发)；G，原球茎的出现；H，长出第1片子叶；I，出现第2片子叶(幼苗)图1 白芨种子的结构与萌发过程(100×)

播种10 d左右，显微镜下观察发现，种子吸水膨胀，颜色由最初的浅褐色逐渐转变为黄绿色，这些种子往往可以继续萌发。部分种子无吸水膨胀现象或胚吸水膨胀后转变成深褐色或黑色，这些种子后期不会萌发。播种20 d后，培养条件适宜的种子出现胚轴和叶原基(图1中C)。

白芨种子的萌发和原球茎的发育可划分为5个阶段：0阶段，白芨种子种皮完整，不开裂(图1中D)；1阶段，种胚膨大变绿(图1中E)；2阶段，种胚继续膨大，种皮破裂(即萌发)(图1中F)；3阶段，原球茎出现(图1中G)；4阶段，长出第1片子叶(图1中H)；5阶段，出现第2片子叶(即幼苗)(图1中I)。

2.2 NAA、6-BA和土豆泥处理组合对白芨种子萌发的影响

播种30 d后观察种子的萌发情况(图2)，并统计比较白芨种子的萌发率(图3)，数据分析后发现，不同培养基中种子的萌发有显著性差异。其中，萌发率最高的7号培养基可达到(83.47±3.11)%，其次是2号培养基(76.23±8.32)%，萌发率最低的为8号培养基(50.27±4.85)%。1、2、4号培养基在7～8 d开始吸水膨胀，10 d左右种子由浅褐色逐渐转变为黄绿色，15 d左右从中部突破种皮开始萌发。

图2 9种培养基上白芨种子的萌发情况

图3 9种培养基上白芨种子的萌发率

白芨种子萌发率极差分析显示，激素NAA因素的极差最大(15.55百分点)，其次是6-BA(12.66百分点)，最小的为土豆泥(6.28百分点)。表明NAA含量对白芨种子萌发的影响最大，土豆泥、6-BA和NAA对种子萌发的影响程度为土豆泥<6-BA

2.3 NAA、蔗糖、香蕉泥与椰子汁处理组合对白芨组培苗壮苗生根培养的影响

不同浓度的植物激素和添加物对白芨组培苗的生长有较大影响(图4)。当培养基中未添加NAA、香蕉泥和椰子汁时，白芨幼苗生长缓慢，植株矮小，产生的新根数量最少，而基本培养基中添加10 g·L-1蔗糖、0.5 mg·L-1NAA、75 g·L-1香蕉泥和100 mL·L-1椰子汁组合时，白芨组培苗健壮，叶色浓绿，叶片明显增加，根系粗壮(表1)。

图4 9种培养基上白芨壮苗的生根情况

培养基编号生根率/%生根数/条鲜质量/g生长情况11005.20.2992±0.1976e植株矮小,叶绿210011.41.2971±0.3871a植株健壮,叶绿,叶片增加,根系粗壮310010.20.6975±0.2416bc植株叶色黄绿,较健壮41006.20.4070±0.0922d植株叶色黄绿,根少且细长,长势一般51009.60.7483±0.2094b植株叶色黄绿,长势良好610010.71.0718±0.5947ab植株健壮,叶绿,长势良好71006.80.4644±0.3299d植株叶色黄绿,长势一般81007.10.7055±0.1975b植株叶色黄绿,长势一般91007.30.6300±0.3230c植株叶色浅绿,长势不均匀

白芨壮苗生根后鲜质量的极差分析结果显示，NAA含量因素的极差最大(0.526 8 g)，表明NAA对白芨组培苗鲜质量的影响最大，各因素对鲜质量的影响程度为：NAA>香蕉泥(0.387 8 g)>椰子汁(0.366 3 g)>蔗糖(0.164 6 g)。白芨生根数极差分析结果显示，对白芨生根影响最大的因素也是NAA(3.33条)，各因素对白芨生根的影响程度为NAA>香蕉泥(2.80条)>椰子汁(2.33条)>蔗糖(1.86条)。NAA是影响白芨壮苗生根的主要因素，而蔗糖对壮苗生根的影响不大。总体来看，1/2 MS+NAA 0.5 mg·L-1+香蕉泥75 g·L-1+椰子汁100 mL·L-1+蔗糖10 g·L-1+活性炭2 g·L-1+琼脂6 g·L-1，pH 值5.8，有利于白芨的壮苗生根。

3 小结与讨论

白芨的种子呈浅褐色纺锤形，由种皮和胚2部分组成。由于其不具胚乳，只有发育不完全的原胚，内部储存的少量营养物质不能提供种子萌发所需的全部营养，因此，种子在野生状态下需与真菌共生才能萌发[13]。白芨种子在成熟的过程中先形成种皮，再发育成胚，显微观察发现有很多种子只有种皮没有胚，这可能是由于部分种子并没有完全成熟。种子在萌发培养基上生长10 d左右，显微镜下观察发现种子吸水膨胀，颜色由最初的浅褐色逐渐转变为黄绿色，这些种子往往可以继续萌发，而部分种子无吸水膨胀现象或其胚吸水膨胀后转变成深褐色或黑色，这些种子后期也不会萌发。这可能是种子没有胚或培养条件不适宜等引起的。

目前，白芨大多以分株繁殖为主，但繁殖系数低，成本高，无法满足市场的药用需求，采用组培快繁的方式繁殖种苗是一个较好的选择。本文主要探索了不同激素和添加物浓度组合对白芨种子萌发和壮苗生根的影响。前人研究发现，1/2 MS培养基是白芨种子萌发的最适基础培养基，激素和其他添加物在白芨种子萌发过程中也起着重要作用[14-16]。6-BA在较低浓度时，随着浓度的增加，萌发率增加，但超过一定浓度时，萌发率反而下降[17]。NAA和土豆泥也可以促进白芨种子的萌发[18]。本研究以1/2 MS为基础培养基，添加不同浓度6-BA、NAA和土豆泥，结果发现，白芨种子在9种培养基上随着时间的延长均能萌发，NAA对白芨种子萌发的影响最大，其次是6-BA，土豆泥的影响最小。最适合白芨种子萌发的培养基为1/2 MS+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+200 g·L-1土豆泥，萌发率可达83.47%±3.11%。

余朝秀等[7]研究发现，以1/2 MS为基本培养基，0.5 mg·L-1NAA是最佳生根浓度。吴华芬等[19]研究发现，生根率可达100%的生根培养基为1/2 MS+NAA 0.5 mg·L-1。本试验结果表明，白芨壮苗生根培养中，各因素对鲜质量和生根数的影响程度均为：NAA>香蕉泥>椰子汁>蔗糖，最适壮苗生根培养基是1/2 MS+0.5 mg·L-1NAA+75 g·L-1香蕉泥+100 mg·L-1椰子汁+10 g·L-1蔗糖，这与袁宁[16]生根培养的结果一致。

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(责任编辑：侯春晓)

2017-06-01

江苏省林业三新工程(LYSX[2015]02)；江苏农林职业技术学院院内项目(2014KJ022，2017KJ31)

席刚俊(1981—)，男，湖北仙桃人，助理研究员，硕士，从事铁皮石斛病害的研究工作，E-mail: 2469250487@qq.com。

韩正敏(1958—)，男，江苏南京人，教授，博士，研究方向为森林微生物，E-mail: zmhan@njfu.edu.cn。