增效助悬剂对堆型艾美耳球虫活卵囊免疫效果的影响

席 柔 ， 朱晓波 ， 郑明学 ，贡 鑫 ， 白 瑞 ，史晨婕 ， 张李琦 ， 苏晓晴 ， 张 黎 ， 徐之勇

(山西农业大学动物科技学院， 山西太谷030801)

增效助悬剂对堆型艾美耳球虫活卵囊免疫效果的影响

席 柔 ， 朱晓波 ， 郑明学 ，贡 鑫 ， 白 瑞 ，史晨婕 ， 张李琦 ， 苏晓晴 ， 张 黎 ， 徐之勇

(山西农业大学动物科技学院， 山西太谷030801)

为检验本课题研制的球虫疫苗免疫增效助悬剂对疫苗免疫效果的功效。通过测定免疫攻毒鸡的相对增重率、死亡率、病变记分、卵囊减少率等来观察和分析鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂对疫苗免疫产生期的影响。结果显示，与饮水对照组相比,增效助悬剂组的相对饮水率为105.89%；一次免疫，增效剂免疫组和免疫对照组鸡群已能对大剂量强毒株攻击产生保护力，但病变记分均≥1，相对增重未达到80%，未达到良好免疫效果；二次免疫，增效剂免疫攻毒组于二免后第6天产生良好免疫保护，免疫对照组于二免后第7天达到良好免疫效果。表明球虫疫苗免疫增效助悬剂不影响雏鸡饮水，且使用该助悬剂可缩短免疫产生期。

球虫 ； 增效助悬剂 ； 免疫产生期

鸡球虫病是由多种球虫引起的一种肠道寄生虫病，15～50日龄的雏鸡发病率和死亡率都极高。免疫预防是目前控制该病较为理想的方法，鸡球虫疫苗为球虫病的防治提供了新的有效途径。鸡球虫疫苗的常用免疫方法有经口滴服、喷雾拌料法、饮水等途径，其中经口滴服和喷雾拌料法有很多不足之处。饮水免疫法简单方便，对鸡只应激小，但由于球虫卵囊密度比水大，将活疫苗加入水中，球虫卵囊会因为重力作用很快下沉，造成免疫不均匀或漏免。在免疫时需要助悬剂使虫苗均匀的悬浮于水中，同时延长鸡只饮水时间，力求使鸡获得均一有效的球虫免疫保护力[1]。

鸡球虫疫苗在免疫接种后通常需要14 d才能产生免疫效力[2]，由于疫苗免疫产生期较长，若接种鸡群在未产生足够免疫力的免疫空白期内感染鸡球虫，则会造成免疫失败。但若为加速免疫效力的产生而加大免疫剂量，则会因影响鸡增重，甚至诱发鸡球虫病，因此缩短免疫产生期是十分有必要的。免疫佐剂可非特异性地改变或增加机体与特异性免疫原性物质结合，刺激机体产生稳定、长期的特异性免疫反应，可缩短免疫产生期，同时减少疫苗用量。

因此将助悬剂与免疫佐剂二者复配制成球虫疫苗免疫增效助悬剂可以提高免疫效果，降低成本。国内将其二者复配制成球虫疫苗免疫增效助悬剂的研究较少，本文通过分析探讨球虫疫苗免疫增效助悬剂在球虫疫苗免疫接种中对免疫效果的影响，为有效使用鸡球虫疫苗控制鸡球虫病的发生发展提供新方法。

1 材料与方法

1.1 试验虫株和动物 堆型艾美耳球虫(E.acervulina)强毒株(Ea04，201311)，和堆型艾美耳球虫早熟株(Eap16，201311)，由山西农业大学兽医病理实验室提供。海蓝白雏鸡，购自山西省太谷县康牧禽业，饲养于经严格消毒后的无球虫的SPF隔离器中。

1.2 主要试剂 球虫助悬剂(卡波姆、HPMC)和鸡球虫病疫苗增效助悬剂(HPMC、卡波姆、黄芪多糖、壳聚糖、葡萄糖)，由山西农业大学兽医病理实验室研制。

1.3 球虫疫苗免疫增效助悬剂对雏鸡饮水量影响试验 将体重近似的20只6日龄雏鸡随机分为2组，分别记为增效助悬剂组T1(8.25 g增效助悬剂溶于100 mL水中)，空白对照组C0(100 mL凉白开水)。称量饮水前T1组和C0组的水壶重量分别为W1、W2，加入饮水后的水壶总重分别为W11、W21，饮水4 h后，剩余饮水的水壶总重分别为W12、W22。计算T1组相对饮水量。

相对饮水率=[(W11-W1)-(W12-W1)]/[(W21-W2)-(W22-W2)]×100%

1.4 球虫疫苗免疫增效助悬剂对球虫疫苗免疫产生期的影响试验 空腹称重后，将体重近似的7日龄健康雏鸡随机分为20组，10只/组，T11～T12为首免增效助悬剂免疫组、T13～T14为助悬液免疫对照组、C11～C12为攻毒对照组，T21～T24为二免增效助悬剂免疫组、T25～T28为助悬液免疫对照组、C21～C24为攻毒对照组和C10、C20为2个空白对照组。

于7日龄，T11～T12和T13～T14分别通过饮用含E.acervulina早熟卵囊(12 000个孢子化卵囊/组)的增效助悬剂稀释液40 mL和助悬液40 mL(球虫助悬剂0.25 g/100 mL水)免疫4 h后换回原来的饮水，首免后8、9 d分别对T11～T12、T13～T14、C11～C12，灌胃攻20×104个/只E.acervulina强毒株，攻毒后观察鸡的精神状态和粪便情况，各组攻毒后第8天空腹称重后剖杀，记录攻毒前和剖解前体重、十二指肠病变记分、死亡率、每克粪便卵囊数(OPG)和粪便重量，计算相对增重率、病变记分减少率、卵囊减少率。

于7日龄，T21～T24组和T25～T28的免疫方法和剂量分别同T11～T12和T13～T14组，首免后第10天分别通过饮用含E.acervulina早熟卵囊(0.9×104个孢子化卵囊/组)的240 mL增效助悬剂稀释液和240 mL助悬液免疫，4 h后换回原来的饮水，二免后于5、6、7、14 d分别对T21～T24、T25～T28、C21～C24灌胃攻20×104个/只E.acervulina强毒株，攻毒后观察和测定指标同首免攻毒组(T11～T12和T13～T14)。

1.5 检测指标和方法

1.5.1 每克粪便卵囊数(OPG) 称取2 g鸡粪，溶于20 mL水中制成10倍的稀释液，搅拌均匀后，血球记数板计数。

1.5.2 小肠病变记分 按Johnson和Reid等[3]推荐的5分制记分法进行记分。

1.5.3 增重情况平均增重=(末总重-初总重)/鸡数；相对增重率(%)=感染组鸡平均增重/健康对照组鸡平均增重×100%。

1.5.4 病变记分减少率(RLS) 按Martin等[4]的标准计算，当RLS≥70%判为有保护力。

1.5.5 卵囊减少率 按McDonald等[5]的标准计算，减少率≥75%判为有保护力。

1.5.6 疫苗免疫效力判定标准 攻毒对照组十二指肠病变记分≥3；免疫攻毒组十二指肠病变记分≤1，病变记分减少率≥70%，相对增重率≥80%，卵囊减少率≥75%判为免疫效果良好。

2 试验结果

2.1 球虫疫苗免疫增效助悬剂对雏鸡饮水量的影响 雏鸡分别饮用凉白开水和增效助悬剂稀释液，4 h后测得相对饮水量为105.89%，表明球虫疫苗稀释液对雏鸡饮水无明显影响，可在日常饮水中加入球虫疫苗免疫增效助悬剂进行免疫，见表1。

表1 球虫疫苗免疫增效助悬剂的相对饮水量

2.2 球虫疫苗免疫增效助悬剂对球虫疫苗免疫产生期的影响

2.2.1 一次免疫后免疫产生期试验 免疫攻毒组鸡精神状态良好，食欲正常，而攻毒对照组鸡出现精神沉郁、羽毛蓬乱、采食减少的现象。各攻毒组鸡攻毒后出现个别鸡拉土黄色的水样稀粪。各组鸡均未死亡。

随着免疫后攻毒时间的推移，首免增效助悬剂免疫组(T11、T12)和助悬液免疫攻毒对照组(T13、T14)相对增重率均呈上升趋势，平均病变记分呈下降趋势。于免疫后第8、9天攻毒，T11、T12组相对增重率、卵囊减少率、RLS高于T13、T14组；T11、T12组平均病变记分低于T13、T14组，且免疫增效助悬剂免疫组和助悬液免疫攻毒对照组平均病变记分均低于攻毒对照组，差异极显著(P<0.01)，但还未达到良好免疫效果，见表2。

表2 一次免疫的免疫产生期

注：大写字母不同表示同一列差异极显著(P<0.01)，小写字母不同表示同一列差异显著(P<0.05)，下表同

2.2.2 二次免疫后免疫产生期试验 攻毒对照组鸡攻毒后表现同首免攻毒对照组，免疫攻毒组鸡精神状态良好，食欲正常，出现个别鸡拉土黄色的水样稀粪，但二免攻毒组程度较首免攻毒组轻。各组鸡均未死亡。

随二次免疫后攻毒时间的推移，增效助悬剂免疫组(T21～T24组)和助悬液免疫攻毒对照组(T25～T28组)的相对增重率、卵囊减少率均呈上升趋势，平均病变记分呈下降趋势。于免疫后第5、6、7、14天攻毒，T21～T24组相对增重率、卵囊减少率高于T25～T28组，平均病变记分低于T25～T28组，增效助悬剂免疫组和助悬液免疫攻毒对照组分别于免疫后大于等于6d和7d达到了良好免疫效果，见表3。

3 讨论与小结

试验结果表明,鸡球虫病疫苗增效助悬剂对雏鸡饮水无明显影响，且饮水免疫后，增效助悬剂组换回白开水，连续观察数小时，雏鸡饮水无异常，可将鸡球虫疫苗增效助悬剂加入日常饮水中来免疫鸡群。使用增效助悬剂的鸡只于二免后第6天达到良好免疫效果并且使疫苗免疫产生期缩短了1d。这是由于免疫佐剂在其中发挥了重要作用，免疫佐剂可促进抗原递呈细胞摄取抗原的速度和分泌白细胞介素的产生，还通过APC向免疫效应细胞递呈免疫原，诱导CD8+T细胞应答，使免疫加速进行[6]。

表3 二次免疫的免疫产生期

两次免疫效果优于一次免疫。顾有方等[7]试验研究了GC02鸡球虫病疫苗不同免疫次数的免疫效果，结果表明，二次免疫的效果优于一次免疫和3次免疫，二次免疫后的鸡群可有效地降低鸡球虫病的发生，且对雏鸡增重有显著的促进作用。卞国志等[8]试验观察不同免疫剂量和免疫次数对E.necatrix免疫保护力的影响，2次免疫处理组的各项指标均明显优于一次免疫组，表明在笼养条件下由于缺乏卵囊的循环感染，1次免疫后所激发的免疫力持续时间较短，要达到球虫病的有效控制，需进行二次免疫接种。

[1] 高冬梅,陈晓月.家禽免疫方法及注意事项[J].家禽科学,2014,06:33-35.

[2] 李洲. 鸡球虫疫苗的免疫效力及使用效益的研究[D].南京：南京农业大学, 2011.

[3] Johnson J,Reid W M.Anticoccidial drugs:lesion scoring techniques in battery and floorpen experiments with chickens[J].Exp Parasitol,1970,8:30-36.

[4] Martin A G, Danforth H D, Barta J R,etal. Analysis of immunologicl cross-protection and sensitivities to anticoccididial drugs among five geographical and temporal strains of Eimeria maxima [J].In t J Parasito, 1997, 27(5): 527-533.

[5] McDonald V,Shirley M W, Bellatti M A. Eimeria maxima: characteristics of attenuated lines obtained by selection for precocious development in the chicken [J]. Exp Parasit,1986,61:92-200.

[6] 李学钊,洪炀,王治仓,等. 免疫佐剂研究进展及前景展望[J]. 中国动物传染病学报, 2014, 22(4): 81-86.

[7] 顾有方, 蔡汉乔, 陈会良, 等. GC_(02)鸡球虫病疫苗免疫效果的观察[J]. 中国预防兽医学报，2006, 28(5): 553-558．

[8] 卞国志, 蔡建平, 谢明权, 等. 不同剂量和免疫次数对鸡毒害艾美尔球虫免疫保护力度影响[J]. 中国兽医学报, 2006, 26(1): 39-42．

Effect of Synergy Suspending AgentsonE.acervulinaOocysts Immunization

XI Rou , ZHU Xiao-bo , ZHENG Ming-xue , GONG Xin , BAI Rui , SHI Chen-jie , ZHANG Li-qi , SU Xiao-qing , ZHANG Li , XU Zhi-yong

(College of Animal Science&.Technology of Shanxi agriculture, Taigu 030801，China)

In order to test the effect of synergy suspending agents on chicken vaccine immunization,we analyzed the immune efficacy of the vaccine by measuring the relative weight gain rate,mortality rate,intestinal lesion scores,and oocysts reduction rate.The results showed that compared with control group,the relative drinking water rate of the synergy suspending agent group was 105.89%. In the first immunization, the chicken in the synergy suspending agent group and immunization group already had the good protective immunity on the challenge of megadose virulent strain,although the average lesion scores in both groups were more than 1,and the relative weight gain rate didn’t reach 80%.In the second immunization,the chicken in synergy suspending agent group had a good immune protection at day 6 and the chicken in immunization group had a good immune protection at day 7. Our findings indicate that this synergy suspending agent can be added in chicken immunization,and the immune production time is shorten.

Coccidium ; Synergy Suspending Agent ; Immune Production Time

ZHENG Ming-xue

2016-09-23

国家自然科学基金项目(31272536)；山西省现代农业鸡产业技术系项目上(2016-11-03)

席柔(1993-)，女，硕士生，主要从事鸡球虫发病与免疫机理研究，E-mail:781837589@qq.com

郑明学,E-mail:zhengmingxue288@163.com

S852.4

A

0529-6005(2017)07-0024-03