不同五味子类木脂素成分对损伤肝细胞的保护作用比较

王陈萍　许波　蔡向明

[摘要] 目的 分别评价五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子丙素、五味子酯甲对损伤肝细胞的保护作用。 方法 采用过氧化氢（H2O2）诱导HL-7702肝细胞损伤模型，在五味子甲素组中，将细胞随机分为正常组、模型组及1、5、25 μmol/L五味子甲素加药组，采用CCK-8法检测五味子类甲素对损伤HL-7702细胞增殖力（A值）的影响，采用自动生化分析仪检测五味子类甲素对损伤肝细胞释放谷草转氨酶（AST）的影响。其余五味子乙素、醇甲、醇乙、丙素、酯甲等组与甲素组操作相同。 結果 与各自的模型组比较，五味子甲素、醇甲3个浓度组A值及AST浓度差异无统计学意义（P > 0.05），五味子醇乙、乙素、丙素的1、5 μmol/L组及五味子酯甲25 μmol/L组A值显著提高（P < 0.05），AST浓度显著降低（P < 0.05）。 结论 不含有亚甲二氧基的五味子甲素、醇甲对损伤肝细胞无保护作用，含有亚甲二氧基的五味子醇乙、乙素、丙素和酯甲对损伤肝细胞具有一定的保护作用。

[关键词] 五味子；联苯环辛烯类木脂素；亚甲二氧基；活性基团；氧化损伤；保肝作用

[中图分类号] R286.55 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）07（a）-0035-04

[Abstract] Objective To evaluate the protective effects of deoxyschizandrin， schisandrin B， schisandrol A， schisandrol B， schisandrin C and schisantherin A on injured hepatocytes， respectively. Methods The H2O2 was used to induce model of injured HL-7702. In the deoxyschizandrin groups， the cells were randomly divided into normal group， model group and 1， 5， 25 μmol/L of deoxyschizandrin dosing group. The influence of deoxyschizandrin for the proliferation （A value） of injured HL-7702 was detected by cell counting kit-8， meanwhile， the influence of deoxyschizandrin for the aspartate aminotransferase （AST） released by the injured hepatocytes was detected by automatic biochemistry analyzer. The other groups of schisandrin B， schisandrol A， schisandrol B， schisandrin C and schisantherin A had the same operation with deoxyschizandrin. Results Compared with model groups， there were no significant differences of A values and AST concentration in the three concentration groups of deoxyschizandrin and schisandrol A （P > 0.05）， while the A values in 1， 5 μmol/L groups of schisandrol B， schisandrin B， schisandrin C and 25 μmol/L group of schisantherin A were increased significantly （P < 0.05）， the AST concentrations in which were decreased significantly （P < 0.05）. Conclusion Deoxyschizandrin and schisandrol A without any methylenedioxy have no protective effects for the injured hepatocytes， while schisandrol B， schisandrin B， schisandrin C and schisantherin A with the methylenedioxy have certain protective effects for the injured hepatocytes.

[Key words] Fructus Schisandrae Chinensis； Dibenzocyclooctadiene lignans； Methylenedioxy； Active group； Oxidative damage； Hepatoprotective effect

五味子类木脂素主要分布于五味子科[1]，是五味子科植物的特征性成分[2]。该科植物五味子[Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.]和华中五味子（Schisandra sphenanthera Rehd. et Wils.）的干燥成熟果实分别作为“五味子”和“南五味子”入药[3]。20世纪70年代，我国学者发现五味子和南五味子具有明显的保肝降酶作用，其活性成分主要为五味子类木脂素[4]。目前研究较多的主要有五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子丙素和五味子酯甲[5]，其中五味子醇甲、醇乙、乙素和丙素为五味子的特征性成分[6]，五味子甲素和酯甲为南五味子的特征性成分[7]。

研究发现，五味子类木脂素保肝活性存在构效关系[8]，一般认为苯环上的亚甲二氧基是该类成分的重要活性基团[9-10]。20世纪80年代，日本学者Hikino等[11]对23个该类成分进行体外保肝活性评价，结果显示，结构中有2个亚甲二氧基的五味子丙素活性较强，有1个亚甲二氧基的五味子乙素、醇乙、酯甲有活性，无亚甲二氧基的五味子醇甲、甲素无活性；但同时也显示，其中有4个成分含亚甲二氧基却没有活性，而不含此基团的戈米辛J却有活性。即目前研究结果并未完全证实亚甲二氧基是五味子类木脂素的保肝活性基团。本研究采用过氧化氢（H2O2）诱导复制HL-7702肝细胞损伤模型，对6个代表性五味子类木脂素成分进行保肝活性评价，以期阐明该类成分对损伤肝细胞的保护作用的构效关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人肝细胞（HL-7702），购自中国科学院细胞库。

1.1.2 药品及试剂 五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙及五味子酯甲（产品批号DR20140627，纯度均≥98%）购自鼎瑞化工（上海）有限公司；3%H2O2（产品批号1511171）购自遂成药业股份有限公司；RPMI1640培养液（产品批号20151118）、胎牛血清（产品批号20150130）均购自美国Gibico公司；0.25%胰酶消化液（产品批号0310181503）、二甲基亚砜（DMSO，产品批号0201031502）、CCK-8（产品批号0303211504）试剂盒均购自碧云天生物技术研究所。

1.1.3 仪器 BBS-DDC潔净工作台（济南鑫贝生物技术有限公司）；CO2培养箱（Thermo scientific公司）；RT-6000酶标仪（深圳雷杜公司）；AU2700自动生化分析仪（日本OLYMPUS公司）；-80℃冰箱（中科美菱公司）；SK5200H超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；Sartorius BT 25S型丢案子天平（德国赛多利斯公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、分组及处理 HL-7702细胞在含有10%胎牛血清、1%双抗（100 U/mL青霉素+100 mg/L链毒素）的RPMI1640培养基中，于5%CO2、37℃、饱和湿度培养箱中培养。细胞贴壁生长，每2天进行细胞换液，长至80%左右融合后以0.25%胰酶消化传代。细胞传至第3代后铺96孔板及48孔板，继续培养24 h。在五味子甲素实验组中，将细胞随机分为正常组、模型组及1、5、25 μmol/L五味子甲素加药组，每组6个复孔。正常组细胞未经任何处理；模型组每孔加入500 μmol/L的H2O2处理4 h；1 μmol/L五味子甲素加药组每孔加入终浓度为1 μmol/L的五味子甲素预处理24 h后，继续加入终浓度为1 μmol/L的五味子甲素及500 μmol/L H2O2组共处理4 h；5、25 μmol/L五味子甲素加药组操作同1 μmol/L加药组。五味子乙素、丙素、醇甲、醇乙、酯甲实验组操作均同五味子甲素实验组。

1.2.2 CCK-8试剂盒检测HL-7702细胞活性 将HL-7702细胞按每孔8×104/mL、每孔100 μL均匀铺在96孔板上，在5%CO2、37℃、饱和湿度培养箱中培养24 h，然后按上述分组进行处理。处理完后每孔加CCK-8试剂10 μL，37℃孵育1 h，选择450 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光度（A）值。计算对肝损伤细胞有保护作用的实验组细胞恢复率，细胞恢复率=（加药组A值-模型组A值）/（正常组A值-模型组A值）×100%[12]。

1.2.3 自动生化分析仪检测HL-7702细胞上层液中谷草转氨酶（AST）浓度 将HL-7702细胞按每孔1.5×105/mL、每孔200 μL均匀铺在48孔板上，在5%CO2、37℃、饱和湿度培养箱中培养24 h，然后按上述分组进行处理。收集上清液，自动生化分析仪检测各上清液中AST浓度。

1.3 统计学方法

使用SPSS 20.0统计软件包进行统计处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，样本数据比较采用单因素方差分析和LSD检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度五味子类木脂素成分对损伤肝细胞活力的影响

与正常组比较，模型组细胞增殖（A值）均明显下降（P < 0.05），表明肝细胞损伤模型造模成功。与模型组比较，1、5、25 μmol/L五味子甲素加药组和五味子醇甲加药组细胞增殖活力差异无统计学意义（P > 0.05），五味子乙素、丙素、醇乙的1、5 μmol/L组及五味子酯甲25 μmol/L组A值显著提高（P < 0.05）。见表1。一定浓度的五味子乙素、醇乙、丙素、酯甲均能使损伤肝细胞恢复。与另两个浓度比较，5 μmol/L的五味子乙素、丙素及醇乙作用较强（P < 0.05）；25 μmol/L的五味子酯甲作用较强（P < 0.05）。见表2。

2.2 不同浓度五味子类木脂素成分对损伤肝细胞释放AST浓度的影响

与正常组比较，模型组细胞上清液中AST浓度均明显上升（P < 0.05），表明肝细胞损伤模型造模成功。与模型组比较，1、5、25 μmol/L五味子甲素加药组和五味子醇甲加药组细胞上清液中AST浓度差异无统计学意义（P > 0.05），五味子乙素、丙素、醇乙的1、5 μmol/L组及五味子酯甲25 μmol/L组AST浓度显著降低（P < 0.05）。见表3。

3 讨论

肝脏在调节身体多种功能上起着至关重要的作用，包括合成、分泌和代谢等。氧化应激是指体内氧化作用与抗氧化作用失衡，抗氧化作用减弱，体内产生大量的活性氧自由基（ROS）且不能及时清除，最终引起组织器官损伤的负面反应[13]。H2O2是活性氧之一，易跨过细胞膜与细胞内的金属离子反应产生自由基，从而进攻细胞内成分，如膜脂、蛋白质、酶、核酸等，引起广泛的氧化损伤[14]。因此，H2O2是一种用于诱导肝细胞氧化损伤最为常用的肝毒素[15]。当H2O2诱导肝细胞损伤时，肝细胞的活力受到影响，且肝内转氨酶会被释放到细胞外。因此，实验中选择细胞增殖力和细胞上清液中AST浓度作为考察指标。

在预实验中，将HL-7702细胞与0.25、0.5、1、2 mmol/L的H2O2作用4 h，采用CCK-8法测定其细胞存活率依次为76%、62%、56%、52%，与正常组比较有明显差异（P < 0.05），表明H2O2可明显造成肝细胞氧化损伤。其中，0.5 mmol/L造成的氧化损伤相对缓和。研究发现，若损伤后细胞存活力过低，则细胞大量死亡，已造成不可逆性损伤[16]，表明H2O2损伤过于强烈，不利于研究细胞生物学行为改变。因此，选用0.5 mmol/L的H2O2作为HL-7702细胞氧化损伤的浓度。

本研究结果表明，五味子甲素、醇甲体外对肝细胞损伤无保护作用，而五味子乙素、醇乙、丙素及酯甲体外对肝细胞损伤具有一定的保护作用，推测这6种特征性成分的保肝活性与它们的化学结构有一定的关系。结构分析可知，五味子甲素、醇甲不含有亚甲二氧基，而五味子乙素、醇乙、丙素及酯甲均含有亚甲二氧基。本研究表明，在体外实验中亚甲二氧基可能是保肝活性的重要基团。

20世纪70年代末80年代初，我国学者包天桐等[17]、Liu等[18]分别对从北五味子和南五味子提取得到的7种和6种木脂素进行了小鼠体内保肝活性评价，结果表明苯环上没有亚甲二氧基的五味子醇甲和五味子甲素在体内显示了较强活性，该结果也得到了近年来的研究证实[19-20]。其原因可能是五味子类木脂素的结构在体内发生了代谢转化，有研究发现五味子类木脂素苯环上的亚甲二氧基体内代谢过程中可开环，相邻的甲氧基也可环合成亚甲二氧基[21]。因此，五味子类木脂素的保肝活性构-效关系的阐明必须基于体内过程分析研究。有鉴于此，本课题组后期将对五味子醇甲等6个代表性五味子类木脂素成分进行体内保肝活性评价，并对其体内代谢产物进行分析鉴定，为充分利用该类化合物的保肝作用及指导新化合物的合成提供理论依据。

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（收稿日期：2017-01-16 本文编辑：张瑜杰）