31种药用植物HMGR蛋白的生物信息学分析

郝爱平+国会艳+薛巨坤

摘要：利用生物信息学方法对大戟（Euphorbia pekinensis）、曼地亚红豆杉（Taxus media）、球药隔重楼（Paris fargesii）等31种药用植物HMGR蛋白质的理化性质、亲/疏水性、跨膜结构、蛋白质二级结构、信号肽等进行预测和分析。结果表明，31种药用植物HMGR蛋白氨基酸残基数量大部分在500～600 aa之间；大多数定位于质膜上；分子质量在58～65 ku之间；主要富含Gly、Ala、Leu、Ser和Val等氨基酸。HMGR蛋白具有一定的亲水性，含有两个跨膜结构域，均不具有信号肽，二级结构的主要构件为α-螺旋和不规则卷曲。曼地亚红豆杉、罗汉果、假马齿苋、苍术、秦艽、土沉香、丹参、银杏、黄花蒿HMGR蛋白为稳定蛋白，而其余均为较不稳定蛋白。同源性分析表明，除了灵芝以外，其他植物均聚集在同一枝上，药用植物HMGR蛋白有较高的保守性。

关键词：药用植物；生物信息学；HMGR；萜类化合物

中图分类号：Q71；R282.71 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）14-2761-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.14.042

Abstract： The physical and chemical properties，Pro/hydrophobicity，transmembrane structure，protein two structure，signal peptide and other aspects of the prediction of the HMGR protein of 31 kinds of medicinal plants were analyzed by using bioinformatics methods and tools，including Euphorbia pekinensis，Taxus media， Paris fargesii and other 31 kinds of medicinal plants. Results showed thatthe number of amino acid residues of HMGR protein of 31 medicinal plants was mostly between 500 aa and 600 aa；Most localized on the plasma membrane；Molecular mass was 58～65 ku；Mainly riched in Gly，Ala，Leu，Ser and Val and other amino acids. HMGR protein has a certain degree of hydrophilicity，which contains two transmembrane domains，and has no signal peptide. The main component of the two stage structure was alpha helix and random coil. The HMGR proteinof Taxus media，Siraitia grosvenorii，Bacopa monnieri，Atractylodes lancea，Gentiana macrophylla，Aquilaria sinensis，Salvia miltiorrhiza，Ginkgo biloba and Artemisia annua were a stable protein，while the rest were less stable protein. In addition to ganoderma lucidum，other plants were gathered on the same branch，which showed that the medicinal plant HMGR protein has a high conservation.

Key words： medicinal plants； bioinformatics； HMGR； terpenoids

萜類化合物种类繁多，广泛存在于植物、动物以及微生物等体内。截至目前，已经从生物界中鉴定了50 000种以上，而大多数萜类化合物是从植物中分离得到的[1]。萜类化合物的结构极其多样化，生理作用更是复杂多样，它所产生的应用价值和经济价值都是非常可观的，目前在医疗卫生、工农业生产、能源等领域均作为重要原料使用[2]。该类成分具有较好的抗菌、抗病毒、抗肿瘤等活性。目前应用于实际的有抗肿瘤特效药物紫杉醇（Paclitaxel）、抗疟药特效药物青蒿素（Artemisinin）以及用于临床治疗心血管系统疾病的丹参酮（Bunge）[3-5]。某些植物的香精、树脂、色素油（柠檬烯）、类胡萝卜素和天然橡胶等的主要成分都是由萜类化合物构成的；萜类化合物在植物与无机生活环境的互作中也发挥着重要作用，如植物对昆虫的防御力、增强植物的抗病能力、化感作用、与其他种群的互利关系等[6，7]。

萜类化合物合成的途径主要分为两种途径[8]，第一条途径是甲羟戊酸（Me-valonate，MVA）途径，在细胞质中完成；第二条途径是2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP）途径，在质体中完成[8]。MVA途径是2个乙酰CoA分子在乙酰乙酰CoA转运酶作用下形成乙酰乙酰CoA，经羟甲基戊二酰CoA合酶催化形成3-羟基-3-甲基戊二酰CoA，在羟甲基戊二酰CoA还原酶（HMGR）和2个NADPH分子催化下生成MVA，而后MVA在MVA激酶的作用下，形成甲羟戊酸-5-磷酸，接下来在二氧磷基MVA激酶作用下生成MVA-5-二磷酸，最终在MVA焦磷酸脱羧酶作用下生成IPP[2]。有大量相关试验研究指出两条途径并不是完全独立存在的，而是有相互交叉存在的IPP基因。IPP是MVP和DXP两条途径的交汇处，两条途径所产生的IPP可以穿过质体膜互为对方所用[3]，合成途径如图1所示。

植物MVA的途径中的第一个关键酶是3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMGR），与NADPH催化3-羟基-3-甲基戊二酰CoA生成甲羟戊酸，该反应是不可逆的反应，更是萜类合成的一个重要的调控位点[9]。武莹[10]克隆了药用植物雷公藤（Tripterygium wilfordii）HMGR基因，其全长序列为1 909 bp，包括98 bp的5′上游序列，50 bp的3′序列，该序列以Poly A结尾，开放阅读框1 860 bp，编码579个氨基酸。罗红梅等[11]克隆了人参（Panax ginseng）的一个HMGR基因片段，该基因片段全长1 770 bp，编码589个氨基酸残基，不含信号肽，包括两个跨膜结构域，HMGR的表达直接促进人参皂苷的合成。陈凤美等[12]首次克隆了播娘蒿（Descurainia sophia）HMGR基因458 bp保守区片段。韩兴杰等[13]通过PCR方法从茶树（Camellia sinensis）中克隆了1个编码HMG-CoA还原酶的cDNA全长序列，该序列由1 979 bp组成，包含1个1 722 bp的完整开放阅读框，编码573个氨基酸。邢朝斌等[14]克隆了刺五加（Acanthopanax senticosus）HMGR基因，开放阅读框全长1 713 bp，编码570个氨基酸。有药用植物橡胶草（Taraxacum kok-saghyz Rodin）、乌拉尔甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）、巨尾桉（Eucalyptus grandis×E.urophylla）和甜瓜（Cucumis melo）等HMGR基因被克隆。Majdi等[15]从小白菊（Chrysanthemum parthenium）中克隆出HMGR基因，该基因在小白菊花中表达表达量最高。李非非等[16]对刺五加HMGR基因的表达进行了系统分析，结果表明，HMGR基因在根茎叶等器官中均有表达，但相对表达量间有较大的差异；不同产地的刺五加其HMGR基因的表达量与总皂苷成正相关。杨锦芬等[17]报道拟南芥（Arabidopsis thaliana）的HMGR1基因在番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）中过量的表达，可使番茄中的植物甾醇含量增加到2.4倍。刘颖等[18]克隆了甘草（Glycyrrhiza uralensis）的HMGR基因全长序列并构建了该基因的原核表达载体，通过产物纯化得到了60 ku的HMGR蛋白，表明该蛋白能较好完成特定的酶促反应任务。Ramm等[19]通过试验证实甲羟戊酸途径是青蒿素生物合成的主要来源，且HMGR限制植物黄花蒿中青蒿素的合成和积累。Nafist等[20]证实HMGR基因的过量表达，可以增加了黄花蒿中青蒿素的产量。Olofssonl等[21]研究发现，与其他组织相比，HMGR基因在黄花蒿老叶片中的表达量较低。

本研究采用生物信息学的分析方法，以杜仲为重点，对大戟、曼地亚红豆杉、球药隔重楼等31种药用植物HMGR蛋白氨基酸序列理化特性、系统进化、亲/疏水性、植物亚细胞定位、跨膜结构域、蛋白质二级结构、信号肽等进行预测和分析，为深入开展药用植物HMGR蛋白的酶学特性、萜类化合物生物合成的分子机制等研究提供理论依据。

1 材料方法

1.1 数据来源

氨基酸序列均来自于NCBI中已登录的序列：大戟（Euphorbia pekinensis：ABK56831.1）、曼地亚红豆杉（Taxus media：AAQ82685.1）、球药隔重楼（Paris fargesii：AGC13078.1）、南非醉茄（Withania somnifera：ADN39417.1）、罗汉果（Siraitia grosvenorii：AEM42971.1）、假马齿苋（Bacopa monnieri：ADX31914.1）、小木通（Clematis armandii：AEU08408.1）、甘草（Glycyrrhiza uralensis：ADM87300.1）、杜仲（Eucommia ulmoides：AAV54051.1）、西洋参（Panax quinquefolius：ACV65036.1）、砂仁（Amomum villosum：ACR02667.1）、苍术（Atractylodes lancea：ABK88909.1）、蹄叶橐吾（Ligularia fischeri：ABJ16394.1）、三七（Panax notoginseng：AIK21780.1）、雷公藤（Tripterygium wilfordii：ALU11310.1）、泽泻（Alisma plantago-aquatica Linn. ：AKR79505.1）、盾叶薯蓣（Dioscorea zingiberensis：AGN32411.1）、秦艽（Gentiana macrophylla：AFN89599.1）、长春花（Catharanthus roseus：AAT52222.1）、人参（Panax ginseng：AIX87980.1）、土沉香（Aquilaria sinensis：AGA83240.1）、龙胆草（Gentiana lutea：BAE92731.2）、铁皮石斛（Dendrobium catenatum：AGA18962.1）、刺五加（Eleutherococcus senticosus：AFM77981.1）、丹参（Salvia miltiorrhiza：ACT65734.1）、银杏（Ginkgo biloba：AAU89123.1）、穿心莲（Andrographis paniculata：AAP14352.2）、紫草（Arnebia euchroma：ABE27875.1）、胡黄连（Picrorhiza kurrooa：ABC74565.1）、灵芝（Ganoderma lucidum：ABY84848.1）、黄花蒿（Artemisia annua：AAD47596.1）共計31种药用植物。

1.2 方法

运用在线软件ProtParam分析药用植物HMGR蛋白氨基酸序列理化性质；运用在线软件ProtScale分析药用植物HMGR蛋白亲/疏水性；运用在线软件PSORT分析HMGR蛋白亚细胞定位；运用在线工具SignalP分析HMGR蛋白信号肽；运用SOPMA软件对HMGR蛋白氨基酸序列二级结构进行分析和预测；运用TMHMM 2.0 Server对HMGR蛋白进行跨膜结构域的分析和预测；运用MEGA 5.1构建分子进化树，相关生物学软件如下表1所示。

2 结果与分析

2.1 药用植物HMGR蛋白的理化性质分析

利用ProtParam在线软件分析大戟、曼地亚红豆杉、球药隔重楼等31种药用植物HMGR基因的氨基酸序列，结果见表2。由表2可知，植物HMGR氨基酸残基数量除了长春花601 aa、泽泻602 aa、灵芝1 126 aa以外，其余31种药用植物均分布在500～600 aa。灵芝HMGR蛋白分子质量最大（13.174 9 ku）；其余31种药用植物HMGR蛋白分子质量均为58～65 ku。31种药用植物HMGR蛋白的理论等电点大小不等，土沉香最小（5.69），灵芝最大（8.51）。根据稳定指数在40以下则为稳定蛋白质，40以上为不稳定蛋白的标准，表明曼地亚红豆杉、罗汉果、假马齿苋、苍术、秦艽、土沉香、丹参、银杏、黄花蒿HMGR蛋白为稳定蛋白，而其余均为较不稳定蛋白，曼地亚红豆杉HMGR蛋白最为稳定，其不稳定指数低至32.94，长春花HMGR蛋白最为不稳定，其不稳定指数为51.76。Gly、Ala、Leu、Ser、Val在大戟、曼地亚红豆杉、球药隔重楼等31种植物的HMGR蛋白中含量最为丰富，由此推测其可能与维持HMGR蛋白空间结构的稳定性有关。

对大戟、曼地亚红豆杉、球药隔重楼等31种药用植物HMGR蛋白采用PSORT在线生物学软件进行亚细胞定位分析。结果表明，大戟、球药隔重楼、南非酔茄、西洋参、蹄叶橐吾、三七、人参、龙胆草HMGR蛋白定位于线粒体内膜上，小木通HMGR蛋白定位于高尔基体上。其余植物HMGR蛋白定均定位于质膜上。由此推断，在大戟、曼地亚红豆杉、球药隔重楼等31种药用植物体中，虽然HMGR蛋白的定位有所不同，但绝大多数定位于质膜上，少数定位于线粒体内膜上，定位机制较为复杂。

2.2 药用植物HMGR蛋白的疏水性/亲水性分析

利用ProtScale在线软件对大戟、曼地亚红豆杉、球药隔重楼等31种植物的HMGR蛋白疏水性/亲水性进行预测，根据正值表示疏水，其绝对值越大表示疏水性越强；反之负值表示亲水，其值绝对值越大表示亲水性越强；而数值在+0.5到-0.5之间的主要表现为两性氨基酸为标准，以杜仲为例，结果见图2。由图2可知，杜仲HMGR蛋白多肽链中第73位有最低分值-2.667，其亲水性最强；第93位有最高值2.822，其疏水性最强。在整个HMGR多肽链中，亲水性氨基酸数量略多于疏水性氨基酸，因此，杜仲HMGR蛋白表现为一定的亲水性，但亲水性很低。其余几种药用植物的HMGR氨基酸序列的疏水性与亲水性进行预测结果与杜仲相似，可以推测药用植物HMGR蛋白主要表现为亲水性蛋白，但亲水性较低，内部有疏水区。

2.3 药用植物HMGR蛋白的跨膜结构分析

蛋白质序列中的跨膜区域，既可作为膜受体起作用，与此同时也可能是定位于膜上的锚定蛋白或是离子通道蛋白，所以含有跨膜区蛋白往往和细胞的功能状态密切相关，在真菌和动物细胞中的HMGR蛋白的跨膜结构域一般为7～8个跨膜结构域[18]，而植物HMGR一般只有1～2个跨膜结构域[19]。以杜仲HMGR为研究对象，用在线生物学工具TMHMM 2.0 Server进行预测分析，结果如图3所示。由图3可知，该蛋白具有两个跨膜结构域，分别在氨基酸序列的46～68，89～111氨基酸处，同时对大戟、曼地亚红豆杉、球药隔重楼等31种不同药用植物的HMGR蛋白分析和预测，均具有跨膜结构。大部分有两个跨膜结构域，位于30～120氨基酸之间；其中龙胆草只有一个跨膜结构域为33～55氨基酸处；灵芝有3个跨膜結构域，分别位于13～35、222～244、251～270氨基酸处。由于HMGR蛋白具有跨膜结构域，表明其可能为跨膜蛋白。蛋白质的跨膜结构与其功能都是相对应的，因此推测此该蛋白可能为某种物质的膜受体或者参与物质的运输。

2.4 药用植物HMGR蛋白的二级结构分析

蛋白质二级结构指多肽链按照一定的周期性，由氢键维持的空间结构。以杜仲为研究对象进行蛋白质二级结构分析，使用在线网站SOPMA进行分析预测HMGR蛋白的二级结构，结果如图4所示。由图4可知，该蛋白由39.32%的α-螺旋（Alpha helix）、15.93%的延伸链（Extended strandn）、7.80%的β-转角（Beta turn）和36.95%的无规卷曲（Random coil）组成，其中α-螺旋和不规则卷曲是HMGR蛋白中主要的结构元件，散布于整个肽链中。大戟、曼地亚红豆杉、球药隔重楼等其他31种药用植物HMGR蛋白的二级结构中也有类似的情况。

2.5 药用植物HMGR蛋白的信号肽分析

信号肽位于分泌性蛋白N端，一般有16～26个氨基酸残基组成，包括疏水核心区、信号肽的N端和C端3个部分组成，其在分泌性蛋白合成结束将被切除[15]。利用在线工具Signal 4.1 Server分析杜仲HMGR蛋白的信号肽及其位置，结果如图5所示。由图5可知，杜仲HMGR蛋白不具有信号肽的特点，同时对大戟、曼地亚红豆杉、球药隔重楼等31种药用植物分析确定以上植物HMGR蛋白均不具有信号肽的特点，因此推测HMGR蛋白为非分泌性蛋白。

2.6 药用植物HMGR蛋白的分子进化分析

对大戟、曼地亚红豆杉、球药隔重楼等31种不同药用植物的HMGR蛋白序列运用MEGA5.1软件中的NJ法进行分子系统进化分析，结果如图6所示。由图6可知，除了灵芝以外，其他植物均聚集在同一枝上，具有较为亲近的亲缘关系和进化地位。其中亲缘关系较近的假马齿苋、丹参和紫草聚集在同一枝上；长春花、秦艽和龙胆草聚集在同一枝上；同为人参科的人参、西洋参和三七也聚在同一枝上。结果表明，HMGR蛋白具有较高的保守性，可以作为药用植物遗传分子进化的重要理论依据。

3 结论

采用生物信息学的分析方法，以杜仲为例对大戟、曼地亚红豆杉、球药隔重楼等31种药用植物HMGR蛋白进行预测和分析，得出以下结论。

1）31种药用植物HMGR蛋白氨基酸残基数量大部分在500～600 aa，其中灵芝HMGR氨基酸残基数量最大为1 126 aa。分子质量除灵芝为（131.174 9 ku），其余均介于58～65 ku。

2）曼地亚红豆杉、罗汉果、假马齿苋、苍术、秦艽、土沉香、丹参、银杏、黄花蒿HMGR蛋白均为稳定蛋白，而其余均为较不稳定蛋白。

3）31种药用植物HMGR蛋白的亚细胞绝大多数定位于质膜上，少数定位于线粒体内膜上。

4）31种药用植物HMGR蛋白其亲水性氨基酸数量略多于疏水性氨基酸主要表现为亲水性蛋白，但是亲水性很低，内部有疏水区。

5）大部分药用植物HMGR蛋白都有两个跨膜结构域，处于30～120 aa，均不具有信号肽；α-螺旋和不规则卷曲是药用植物HMGR蛋白二级结构的主要元件。

6）除了灵芝以外，其他植物均聚集在同一枝上，具有较为亲近的亲缘关系和进化地位，其中亲缘关系较近的假马齿苋、丹参和紫草聚集在同一枝上；长春花、秦艽和龙胆草聚集在同一枝上；同为人参科的人参、西洋参和三七也聚在同一枝上；药用植物HMGR蛋白有较高的保守性。

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