DNA疫苗浸泡免疫预防鳜鱼传染性脾肾坏死病毒

周伟东+周勇+刘奕+张立强+邓平+艾桃山+曾令兵+喻运珍+喻婷

摘要：以ISKNV MCP基因为目的基因，克隆到真核表达质粒pcDNA3.1（+）中，构建成DNA疫苗pcMCP，对鳜鱼（Siniperca chuatsi）pcMCP DNA疫苗进行浸泡免疫效果研究。结果表明，pcMCP DNA疫苗能够刺激免疫系统，对非特异性免疫和IgM的表达都具有激活作用。免疫后血液中白细胞含量、白细胞吞噬能力和SOD活力都显著提高，14 d时均达到最大。IgM和Mx基因的mRNA表达研究显示，72 h大量表达，96 h达到最大，分别是对照组的3.05倍和2.02倍。攻毒试验显示，浸泡免疫能够有效保护ISKNV感染的鳜鱼，在第11天，浸泡免疫组的累计死亡率仅为40%，而对照组死亡率都达到了100%，pcMCP浸泡免疫降低了ISKNV感染的鳜鱼死亡率。

关键词：鳜鱼（Siniperca chuatsi）；DNA疫苗；浸泡免疫；传染性脾肾坏死病毒

中图分类号：S942.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）14-2731-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.14.034

Abstract：In this study， ISKNV MCP gene was cloned into eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1（+） to construct DNA vaccine，pcMCP，to study the immune effect of DNA vaccine. The results showed that immersion immunity by pcMCP DNA vaccine could stimulate the immune system. After immunization，White blood cell content，leukocyte phagocytosis and SOD were significantly improved，and they reached the maximum at 14th day. The mRNA level of IgM and Mx gene was expressed at 72 h，and reached the maximum at 96 h， and they were upto 3.05 fold and 2.02 fold respectively，compared with control group. Challenge test， immersion immunization could effectively protect the ISKNV infected mandarin fish. at the eleventh day，the total death rate of immersion immunization groupwas only 40%， the control groups were mortality rate reached 100%. So these results showed that immersion immunity of DNA vaccine reduced death of ISKNV infected Mandarin fish.

Key words：mandarin fish（Siniperca chuatsi）； DNA vaccine； immersion immunization； infectious spleen and kidney necrosis virus

病毒性疾病对水产养殖业造成的损失呈上升趋势，且大多缺乏针对性的治疗药物和手段，疫苗防控作为疾病控制方法越来越受到水产养殖业的重视[1，2]。目前，大量使用的注射免疫方式使得水产疫苗在水产养殖业的应用和推广受到了很大的限制。因此，开发使用简单、成本低廉的DNA疫苗和免疫方式對水产养殖业尤为重要。研究表明，基于黏膜系统的疫苗能够提高病原体感染后试验动物的生存能力[3，4]。DNA疫苗不仅能够通过黏膜系统使鱼体产生足够的免疫保护力，同时还能够刺激机体非特异性免疫产生额外的免疫保护力[5-8]。

鳜鱼病毒病对中国的鳜鱼养殖业造成很大危害，其主要病原是传染性脾肾坏死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV）。目前，鳜鱼病毒病还没有特效药物，仍以预防为主，通过水质调节，免疫增强为主，疫苗防治为鳜鱼养殖业急需。由于鳜鱼是肉食性鱼类，性格暴躁，只吃活鱼，口服或注射的免疫方式很难在鳜鱼养殖中使用，疫苗浸泡免疫是鳜鱼免疫的惟一选择。Fernandez-Alonso等[9]在鳟鱼上利用DNA疫苗浸泡免疫预防出血性败血症病毒的研究中，浸泡组在第35天的死亡率比对照组降低了36%。ISKNV主要衣壳蛋白（Major capside protein，MCP）是病毒粒子的主要抗原蛋白，本研究克隆了ISKNV MCP基因，构建了重组MCP基因的DNA疫苗（pcMCP），并对鳜鱼苗进行浸泡免疫，免疫后血液中白细胞含量、白细胞吞噬能力和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）都显著提高，IgM和Mx基因的mRNA在72 h大量表达，pcMCP浸泡免疫降低了ISKNV感染的鳜鱼死亡率。

1 材料与方法

1.1 试验动物

鳜鱼购自武汉佳恒水产鳜鱼繁殖厂，体重40～50 g，试验水池内暂养，水温25 ℃，连续通气。

1.2 DNA疫苗的构建

以ISKNV核酸为模板，利用表1中的引物P1和P2扩增MCP基因全长序列，表中下划线表示限制性内切酶Kpn I和 EcoR I的酶切位点。将PCR产物MCP基因克隆到真核表达质粒pcDNA3.1（+）中，构建DNA疫苗真核表达质粒pcMCP。

1.3 MCP基因在鲤鱼上皮瘤细胞中的表达

将鲤鱼上皮瘤细胞（Epithelioma papulosum cyprini，EPC）接种在6孔板中，用含10%牛血清的M199培养基培养至细胞长成单层后，通过脂质体Lipofectamine 2000，将重组质粒pcMCP转染到EPC细胞中。在转染后72 h将细胞用4%多聚甲醛于4 ℃固定，以兔抗MCP多克隆抗体为一抗，红色荧光探针标记的羊抗兔IgG（H+L）抗体为二抗，DAPE为细胞核染色剂，参照免疫荧光染色试剂盒（Beyotime，免疫荧光染色试剂盒—抗兔Cy3）对转染重组质粒的EPC细胞进行检测。同时用转染空质粒pcDNA3.1（+）的EPC细胞作为对照进行相同操作。

1.4 血细胞计数和白细胞吞噬活性

取样采血后，立即用事先配制的Dacie液稀释血液，血球计数板计血细胞数[红细胞（Blood cell，RBC）与白细胞（White blood cell，WBC）]，重复计数3次。将金黄色葡萄球菌菌液（Staphylococcus aureus）加入终浓度为0.3%的福尔马林溶液，恒温水浴锅28 ℃灭活48 h，即浓度为1×108 CFU/mL的金黄色葡萄球菌，作为吞噬原，置于4 ℃冰箱备用。0.2 mL抗凝血中加入0.05 mL经福尔马林灭活的金黄色葡萄球菌，充分混匀后置25 ℃恒温水浴锅中孵育60 min，每10 min摇匀1次，1 000 r/min离心10 min，吸取白细胞层制涂片3张。Wright-Giemsa染液混合染色，油镜下观察。吞噬活性以吞噬百分比（Phagocytic percentage，PP），计算公式为：PP=N100/100×100%；N100指100个吞噬细胞中参与吞噬的细胞数。

1.5 SOD活力测定

使用超氧化物歧化酶试剂盒（购于南京建城生物工程研究所）进行测定，采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力。

1.6 RT-PCR检测样品中IgM和Mx基因表达量

利用荧光定量PCR分析免疫鳜鱼鱼体免疫相关基因（Mx、IgM）的表达差异。分别在浸泡免疫后12、24、48、72、96 h采样，每组随机取3尾鱼，解剖取其脾脏组织，用Trizol（Invitrogen）提取样品中的总RNA，经DNase Ⅰ消化后，反转录获得cDNA第一链。按照Realtime PCR Master Mix（SYBR Green）试剂盒中的操作说明，在AB Plus one荧光定量PCR仪上对所取的试验样品进行RT-PCR。

1.7 免疫保护试验

将健康鳜鱼（40～50 g）随机分为2组，每组30尾，即对照组和免疫组。免疫组浸泡于浓度为100 ng/mL pcMCP质粒的免疫浸泡液中30 min，对照组浸泡于PBS溶液中，浸泡免疫后25 ℃恒温养殖，投喂鲮鱼。免疫后第28天进行攻毒试验，各组每尾鱼通过腹腔注射10×TCID50 ISKNV，连续观察15 d，记录感染发病和死亡情况，计算相对免疫保护率（Relative percent survival，RPS）。RPS=[1-（免疫组死亡率/对照组死亡率）]×100%

2 结果与分析

2.1 pcMCP的重组质粒构建及真核表达

以鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白MCP基因为目的基因，利用MCP特异性引物PCR扩展MCP基因，插入到真核表达质粒pcDNA3.1（+）中，构建成DNA疫苗pcMCP。PCR鉴定结果显示，大小约为1 300 bp的ISKNV MCP基因成功克隆到真核表达质粒pcDNA3.1（+）上（图1A）。

脂质体Lipofectamine 2000介导真核重组质粒pcMCP转染EPC细胞，转染后72 h间接荧光免疫试验结果显示，转染重组质粒的EPC细胞胞质中可观察到红色荧光见图1B。同时用pcDNA3.1（+）空质粒转染EPC细胞作为对照进行间接荧光免疫试验，未发现任何荧光。这表明成功构建的重组质粒pcMCP能够在EPC细胞中表达。

2.2 鳜鱼血液中白细胞数目和吞噬活性分析

经DNA疫苗浸泡免疫后，免疫组鳜鱼白细胞变化趋势计数结果如图2A所示。DNA浸泡免疫后，鳜鱼外周血白细胞数目都有不同程度的增加，其中14 d和21 d浸泡组白细胞显著高于对照组（P<0.05）。白细胞吞噬试验结果（图2B）显示，在7～21 d浸泡免疫组中白细胞吞噬灭活的金黄色葡萄球菌的吞噬百分比显著高于对照组（P<0.05），第28天的浸泡免疫组的吞噬百分比高于对照组，但差异不显著。同时还发现，鳜鱼白细胞中的中性粒细胞和单核细胞存在吞噬多个灭活的金黄色葡萄球菌的现象。

2.3 对血清超氧化物歧化酶活性的影响

SOD活力检测结果如图3所示，免疫后鳜鱼血清中SOD活力与对照相比有所提高，其中7 d和14 d浸泡免疫組SOD活力显著高于对照组（P<0.05），21 d和28 d浸泡免疫组SOD酶活比对照组有所提高，但差异不显著。

2.4 浸泡免疫对IgM和Mx基因表达的影响

实时定量PCR检测DNA疫苗浸泡免疫对鳜鱼脾脏中IgM mRNA表达变化如图4，在浸泡免疫后48 h内，IgM mRNA表达量与对照组几乎没有变化，72 h后IgM mRNA表达量逐步升高，72 h IgM mRNA表达量是PBS组的2.04倍，96 h达到3.05倍。DNA疫苗浸泡免疫能够有效激活鳜鱼体液免疫。

RT-PCR检测DNA疫苗浸泡免疫对鳜鱼脾脏中Mx mRNA表达变化如图5，浸泡免疫后12 h和24 h，脾脏中Mx mRNA的表达量略低于PBS组， 72 h和96 h的Mx mRNA表达量分别是PBS组的1.45倍和2.02倍。随时间的增加，浸泡免疫组Mx基因表达量逐步增加。

2.5 ISKNV DNA疫苗浸泡免疫的保護效果

用10×TCID50 ISKNV攻毒后，免疫组与对照组在11 d内均出现了不同程度的死亡，死亡时间集中在攻毒的第5天后，如图6所示。DNA疫苗浸泡免疫鳜鱼后产生了较高的免疫力，PCR检测死亡鳜鱼为ISKNV阳性，同时观察其发病症状，与自然环境下感染ISKNV发病症状相同，表明其死亡原因是由于人工感染ISKNV所致。免疫后第11天，ISKNV DNA疫苗浸泡免疫组累计死亡率40%，空质粒pcDNA3.1（+）和PBS对照组累计死亡率为100%。

3 讨论

鱼类的嗜中性白细胞和单核细胞已被证实有很强的吞噬能力，白细胞的吞噬作用是鱼类非特异免疫的重要组成部分[10]。通过对鳜鱼进行DNA疫苗浸泡免疫，鳜鱼白细胞数和白细胞吞噬百分比与对照组相比都有所增加，而且白细胞中大量存在一个白细胞吞噬多个金黄色葡萄球菌的现象。pcMCPE DNA疫苗浸泡免疫后，鳜鱼吞噬细胞的吞噬活性被提高。除此之外，鱼类的红细胞也有一定的吞噬活性，本研究在镜检中也观察到了许多红细胞的吞噬现象，由此可见鳜鱼的红细胞在免疫反应中也发挥了一定的免疫调节作用。

SOD常作为动物体极为重要的一类非特性免疫因子，在各种需氧生物体内广泛存在，它可以抑制和清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤，属于机体内的防御系统酶类。SOD活力与机体的免疫水平密切相关，对增强巨噬细胞的防御功能和整个机体的免疫机能发挥着十分重要的作用[11]。本研究显示，浸泡免疫可以提高血清SOD活力，免疫后7～14 d的血清SOD活力显著高于对照组。

Mx蛋白是一类由I型干扰素（IFN）诱导表达的抗病毒蛋白，当机体或细胞受到病毒感染时，能与其他干扰素诱导的蛋白一起形成体内抗病毒感染的防线，以达到抗病毒的目的。本研究结果表明，浸泡免疫后鳜鱼脾脏中Mx mRNA相对表达量随时间呈上升趋势，72 h和96 h的Mx mRNA含量分别是对照组的1.45倍和2.02倍。DNA疫苗浸泡免疫后，IgM mRNA表达含量随时间呈上升趋势，与对照组比 72 h达到2.04倍，96 h达到3.05倍。pcMCP DNA疫苗浸泡免疫能够激活天然免疫和特异性免疫。在本研究中Mx和IgM mRNA大量表达出现在72 h，疫苗刺激的效应基因表达较晚，可能是因为DNA疫苗浸泡后的细胞摄入、抗原表达、加工、识别，以及免疫效应分子的表达都需要一定的时间。本研究结果与斜带石斑鱼、牙鲆免疫浸泡后IgM基因的表达相一致[12，13]，结合之前的相关报道，IgM表达高峰出现时间可能与鱼的种类、疫苗、免疫方式等有关，DNA疫苗浸泡免疫的产生要晚于蛋白疫苗免疫。

通过对免疫后的鳜鱼攻毒试验显示，DNA疫苗浸泡组在免疫后第11天的累计死亡率为40%，而未免疫组在第11天已经全部死亡，对照组死亡时间主要集中在5～9 d，这与Mx基因和IgM基因在第3天后大量表达相一致。

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