香水百合总黄酮提取液体外抑菌活性研究

杜娟+邹园+罗秋水

摘要：建立了香水百合（Lilium casa blanca）中总黄酮提取液体外抑菌活性的测定方法。以70%乙醇水溶液提取香水百合中的总黄酮，以芦丁为标准品，利用分光光度法测定其总黄酮含量。以金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌为供试菌，采用滤纸片法和最低抑菌浓度法（MIC）测定了提取液的体外抑菌活性。结果表明，香水百合中总黄酮含量为137 mg/g（13.7%）；总黄酮提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈平均直径为13.25 mm，对大肠埃希氏菌的抑菌圈平均直径为9.75 mm；最低抑菌浓度分别为0.587 5 mg/mL（金黄色葡萄球菌）和2.350 0 mg/mL（大肠埃希氏菌）。香水百合总黄酮提取液具有一定的抑菌活性，且对金黄色葡萄球菌的抑菌效果比大肠埃希氏菌好。

关键词：香水百合（Lilium casa blanca）；总黄酮；抑菌活性

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）14-2743-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.14.036

Abstract：Determination on the vitro antibacterial activity of total flavonoids from Lilium casa blanca was established. Total flavonoids were extracted by 70% ethanol water solution，and its contents were measured by spectrophotometric method using rutin as the standard regents. Antibacterial activity was measured by filter paper method and minimum inhibitory concentration （MIC） measurement method. Results showed that the concentration of total flavonoids in Lilium casa blanca was 137 mg/g （13.7%）；the average diameter of inhibition zone was 13.25 mm for Staphylococcus aureus and 9.75 mm for Escherichia coli； the minimum inhibitory concentration was 0.587 5 mg/mL for Staphylococcus aureus and 2.350 0 mg/mL for Escherichia coli. Total flavonoids from Lilium casa blanca showed better antibacterial activity on Staphylococcus aureus than on Escherichia coli.

Key words：Lilium casa blanca； toal flavonoids； antibacterial activity

黄酮类化合物是植物在长期自然选择过程中产生的次生代谢产物。近年来许多研究已表明黄酮类化合物具有多种生物活性，在抗菌、抗氧化、免疫调节等方面均具有显著效果[1]。香水百合（Lilium casa blanca）是一种多年生鳞茎类球根草本植物，主要用于观赏[2]。目前对于香水百合的研究多集中于其挥发性成分[3]，对其他成分研究报道较少。本试验利用乙醇水溶液提取香水百合中的黄酮类化合物，通过抑菌圈法和最低抑菌浓度法（MIC）分别研究了总黄酮提取物对金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌的抑菌活性，得到相应的抑菌圈直径和最低抑菌浓度。试验结果为进一步研究香水百合的营养价值提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

香水百合购于江西农业大学商业街；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）购于上海北诺生物科技有限公司；其余试剂均为市售生化试剂或国产分析纯；粉碎机、水浴锅、灭菌锅、超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 总黄酮的提取 总黄酮的提取：准确称取 0.5 g干燥后的香水百合粉末，以70%乙醇水溶液为提取剂，料液比为1∶30（g/mL，下同），在50 ℃下水浴提取1.5 h，过滤，提取液以70%乙醇定容至100 mL。

1.2.2 总黄酮含量测定 总黄酮含量的测定采用硝酸铝显色法[4]，以芦丁为对照品。标准曲线的绘制：准确称取205 mg干燥至恒重的芦丁粉末，用70%甲醇溶解得芦丁储备液，使用时用70%甲醇稀释至0.205 mg/mL，为芦丁稀释液。准确移取芦丁稀释液0、1、2、3、4、5、6 mL，分别放置于50 mL容量瓶中，加入70%的乙醇溶液至6 mL，再分别加入5%亚硝酸钠各2 mL，振荡均匀，放置6 min，然后加入10%氯化铝1 mL，振荡均匀，放置6 min，最后加4%的氢氧化钠溶液20 mL，摇匀，用水定容至刻度线，放置15 min，在510 nm波长处测定吸光度。以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。提取液总黄酮含量的测定：从100 mL提取液中用移液管移取1.5 mL总黄酮提取液至50 mL容量瓶中，加70%乙醇溶液至6 mL，按测定标准曲线的方法进行测定，求得提取液中黄酮的含量。

1.2.3 抑菌试验 ①试剂配制。培养基的制作：分别称取蛋白胨1.0 g、牛肉膏0.3 g、氯化钠0.5 g和琼脂1.5～2.0 g，蒸馏水溶解至100 mL，pH调至7.2～7.4，即得固体培养基。液体培养基除不加琼脂外，制作方法与固体培养基相同。菌种的活化：分别将金黄色葡萄球菌菌株和大肠埃希氏菌菌种接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面，37 ℃过夜培养。菌悬液的制备：在2个装有100 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中各接种一环活化后供试菌株，于37 ℃恒温培养箱中培养18 h，制得初始菌悬液。用无菌生理盐水采用梯度稀释法将初始菌悬液稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等6个浓度梯度的菌悬液；选取10-5、10-6两个浓度梯度菌悬液各取200 μL分别涂布平板，并作平行试验，于37 ℃培养箱倒置培养18 h后计数。根据计数结果，用无菌生理盐水稀释成合适浓度的菌悬液作为供试菌悬液。②抑菌圈法。每个平皿倒入约20 mL灭菌牛肉膏蛋白胨固体培养基制成平板，待培养基凝固后，分别加入2种菌悬液（金黄色葡萄球菌：1.3×107 CFU/mL，大肠埃希氏菌7.75×106 CFU/mL）各200 μL，用无菌涂布器涂布均匀。用镊子夹取直径为6 mm已经浸取总黄酮提取液的滤纸片，在平板壁上贴合滤纸片至样品不滴落，然后贴于含菌平板上。每个样品平行做两皿，并以浸取生理盐水的滤纸片作为空白对照，37 ℃倒置培養18～24 h后，分别测量各样品的抑菌圈直径（mm）。③最低抑菌浓度法。将总黄酮提取液（C=4.7 mg/mL）用2倍稀释法进行稀释，然后按照培养基-粗提液（4∶1，V/V）的比例混匀摆斜面，分别得到总黄酮含量为2.350 0、1.175 0、0.587 5、0.293 8 mg/mL的斜面培养基。用移液枪点种供试菌悬液10 μL，待菌悬液干后置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，菌落生长被完全抑制的最低药物质量浓度为总黄酮提取液对检测菌的最低抑菌浓度（MIC）。每个受试样平行重复2次，以不含样品的斜面培养基作为空白对照。

2 结果与分析

2.1 香水百合中总黄酮的含量

利用标准曲线法求得标准品的线性回归方程为A=0.011C-0.001 1（R2=0.999 7）。将提取液测得吸光度代入标准曲线中即求得提取液中总黄酮含量为137 mg/g，即样品中总黄酮含量为13.7%。

2.2 抑菌活性

2.2.1 抑菌圈法試验结果 抑菌圈法是通过在涂有菌悬液的固体培养基上贴上浸取试样的圆形滤纸片，滤纸片上的试样会抑制滤纸片周围的菌形成抑菌圈，抑菌圈直径大于6 mm为有抑菌作用，抑菌圈直径越大说明抑菌活性越强[5]。由图1可知，（a）和（b）分别是总黄酮提取液对金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌的抑菌结果。经测量可得，香水百合总黄酮对金黄色葡萄球菌的抑菌圈平均直径为13.25 mm，对大肠埃希氏菌的抑菌圈平均直径为9.75 mm。结果表明，香水百合中总黄酮提取液对金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌均有一定的抑制作用，且对金黄色葡萄球菌的抑制作用强于大肠埃希氏菌。牛立新等[6]研究了3种食用百合鳞茎提取物对4种细菌抑菌作用，结果表明3种食用百合鳞茎提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用均强于对大肠埃希氏菌的抑制作用，与本试验得到的结果相一致。

2.2.2 MIC法试验结果 最低抑菌浓度法是将试样与培养基通过2、4、8、16倍稀释，稀释成不同浓度的培养基，将菌悬液点接于培养基上，观察菌是否生长，在2个菌长与不长的相邻浓度中，菌生长的浓度为最低抑菌浓度[7]。由表1可知，香水百合总黄酮提取液对金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌的最低抑菌浓度（MIC）分别为0.587 5 mg/mL和2.350 0 mg/mL。刘芳等[8]对当归总黄酮醇提取液的体外抑菌活性进行了研究，得到其对金黄色葡萄球菌的MIC为0.5 mg/mL，对大肠埃希氏菌的MIC为1 mg/mL。结果表明，香水百合总黄酮醇提取液对金黄色葡萄球菌的抑制作用与当归相近，但对大肠埃希氏菌的抑制作用稍弱。

3 小结与讨论

本研究以70%乙醇水溶液提取香水百合中的总黄酮，以芦丁为标准品，利用分光光度法测定其总黄酮含量。以金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌为供试菌，采用滤纸片法和最低抑菌浓度法测定了提取液的体外抑菌活性。试验结果表明，香水百合中总黄酮的含量为137 mg/g（13.7%）；总黄酮提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈平均直径为13.25 mm，对大肠埃希氏菌的抑菌圈平均直径为9.75 mm；最低抑菌浓度分别为0.587 5 mg/mL（金黄色葡萄球菌）和2.350 0 mg/mL（大肠埃希氏菌）。试验结果表明，香水百合总黄酮提取液具有一定的抑菌活性，且对金黄色葡萄球菌的抑菌效果比大肠埃希氏菌好。

参考文献：

[1] 王文渊，周振华，龙红萍.复合酶法提取苦瓜叶总黄酮的研究[J].中国食品添加剂，2011，29（4）：107-112.

[2] 张辉秀，胡增辉，冷平生，等.不同品种百合花挥发性成分定性与定量分析[J].中国农业科学，2013，46（4）：790-799.

[3] SANDRA S，HELMUT S，ORTWIN B.Efficiency and mechanism of the antioxidant action of trans-resveratrol and its analogues in the radical liposome oxidation[J].Archives of Biochemistry and Biophysics，2001，391（1）：79-89.

[4] 刘江雏，周荣琪.竹叶提取物总黄酮含量测定方法的改进[J].食品科技，2005，30（7）：76-78.

[5] 周 英，段 震，王 寒，等.卷丹百合提取物的体外抑菌作用研究[J].食品科学，2008，29（2）：94-96.

[6] 牛立新，靳 磊，张延龙，等.三种百合鳞茎提取物的抑菌作用[J].广西植物，2008，28（6）：842-846.

[7] 卞晓霞，罗跃娥，王文洁，等.凤仙透骨草总黄酮的抑菌活性研究[J].中医药信息，2015，32（2）：12-15.

[8] 刘 芳，曹新志，杨王霖.当归总黄酮醇提液的体外抑菌作用研究[J].中国食品添加剂，2015，32（1）：60-63.