高山葱类蔬菜染色体制片方法改进

符家平+郭凤领+邱正明+吴金平+张昊+马璐

摘要：以山韭菜（Allium japonicurn Regel）和红皮洋葱（A. cepa L.）的根尖为材料，参考常规制片方法，对传统的植物染色体制片方法进行了改进。结果表明，改进后的制片方法不仅提高了植物染色体的制片质量，而且节约了时间和成本。

关键词：山韭菜（Allium japonicurn Regel）；红皮洋葱（A. cepa L.）；染色体制片

中图分类号：S633：Q-336 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）14-2707-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.14.027

Abstract： With the root tips of Allium japonicurn Regel and A. cepa L. as materials， we developed and improved a method for preparation of plant chromosome spreadsbased on conventional techniques. The result indicated that this method not only saves the time and cost， but also improves the quality of chromosome slides.

Key words： Allium japonicurn Regel； Allium cepa L.； chromosome preparation

染色体是基因的载体，而基因支配遗传和变异，也调控着染色体的结构和行为。植物的染色体数目与核型确定是对染色体特征进行定性和定量描述的一种基本方法，对研究植物系统演化、物种之间的亲缘关系、起源、进化与分类、远缘杂交及遗传工程中的染色体鉴别等都具有重要的意义[1]。染色体数目与核型的观察主要依赖于染色体制片，目前常用的技术有2种，即压片技术和去壁低渗火焰干燥技术[2]，前者操作简单，但需要制片者取材时间适宜，压片力量适中，载玻片需要干燥数小时后才能镜检，对操作者的熟练程度要求较高；后者需要的制片经验较少，且制片效果较好，但操作过程涉及酒精灯，需要火焰干燥和盖玻片压片，这些中间步骤会对染色体制片效果造成不利影响。而本试验改进后的滴片技術，染色体清晰、分散，不会导致染色体丢失，并且节约了制片时间和成本，具有一定的实际意义。

1 材料与方法

1.1 材料

山韭菜（Allium japonicurn Regel）植株和红皮洋葱（A. cepa L.）种子由湖北省高山蔬菜工程技术研究中心提供，试验在武汉大学生命科学学院植物分子细胞遗传学实验室完成。

山韭菜植株在实验室盆栽，于室温下生长8 d左右后取根尖备用；红皮洋葱种子先用自来水在室温下浸泡10 h左右，然后放入底部垫有湿纱布的培养皿中，将培养皿放入光照培养箱内、25 ℃左右培养5 d后取根尖备用。

1.2 制片方法

1.2.1 预处理 参照文献[2]的制片方法，但做了一些改进。取山韭菜和红皮洋葱刚长出的长度1～2 cm的新根，洗净，放在超净工作台上，用刀片切取根尖顶端部分，长度1～2 mm；取下后装入1.5 mL离心管中，加入水饱和的α-溴代萘溶液1.0 mL，在25～28 ℃水浴锅中处理120～150 min。

1.2.2 前低渗 预处理后的根尖用移液枪吸出α-溴代萘溶液，每次加入去离子水1.0 mL清洗，3～4次后加入去离子水1.0 mL，放置25～28 ℃水浴锅中处理30 min。

1.2.3 固定 用移液枪吸出去离子水，加入1.0 mL刚配制的固定液，避光放入4 ℃冰箱内过夜（固定时间15～20 h），固定液按甲醇∶冰醋酸=3∶1（V/V）配制。

1.2.4 酶解 去掉固定液，用去离子水清洗，每次加入去离子水1.0 mL，清洗3～4次后吸出去离子水，加入2%纤维素酶和2%果胶酶等体积混合的酶液，放入28 ℃水浴锅中酶解3～4 h，酶液的体积为根尖体积的50～60倍。

1.2.5 后低渗 用移液枪小心吸出酶解后的酶解混合液，轻轻加入1.0 mL去离子水，放入28 ℃水浴锅中处理30 min，吸出处理后的去离子水。

1.2.6 制备悬浮液 在离心管中对每个根尖加入15～20 μL刚配制的固定液，用解剖针捣碎根尖，制成细胞悬浮液。

1.2.7 滴片 将移液枪固定在工作台上方60 cm处，干燥后的载玻片斜放在下方，用固定好的移液枪吸取配制的细胞悬浮液，滴在载玻片上，每块载玻片可滴1～3滴悬浮液，20 min后可对载玻片进行镜检。这一步骤是本试验改进的关键，这里应用了自然重力的作用原理，将根尖细胞悬浮液从高处滴下，使载玻片上的染色体自然分散，载玻片上无细胞重叠和细胞原生质堆积现象，操作过程也简单。

1.2.8 镜检 显微镜有相差显微镜和荧光显微镜2类，分别对载玻片镜检，荧光镜检前先进行DAPI荧光染色，然后照相。

2 结果与分析

山韭菜和红皮洋葱染色体制片相差显微镜镜检结果见图1，荧光显微镜镜检结果见图2。从图2可见，经DAPI荧光染色后，可明显看出染色体带型清晰、结构完整，可观察到明显的着丝粒带和四分体结构，具有良好的制片后操作性。压片法在盖玻片挤压过程中，由于受力不一致，可能导致染色体分布不均匀，而且液氮固定后，在揭盖玻片的同时，染色体可能粘在盖玻片上而丢失，揭完盖玻片后，一般要过夜干燥后才能镜检。火焰干燥法虽然制片时间较短，但操作难度较大，染色体不易分开。按1次试验计算，滴片法比压片法至少节约时间1 d，而且不需要液氮，比火焰干燥法操作简单，并且不需要酒精灯。3种制片方法的特点比较见表1。

3 讨论

染色体制片质量是染色体数目统计与核型分析的关键所在，也关系到原位杂交试验的成败；没有一个分裂相多、染色体分散好的制片是无法进行下一步原位杂交试验的。在植物染色体制片过程中，许多人对制片方法进行了探索。陈磊等[3]以胡萝卜（Daucus carota L. var. sativa Hoffm.）根尖为试验材料，对常规胡萝卜染色体制片方法进行改良后，制片质量和获得的所需细胞数量都有了明显提高。为了获得一串红（Salvia splendens Ker-Gawler）多个品种的染色体制片，洪培培等[4]对一串红染色体压片技术进行了优化，得到6个一串红品种的高清晰染色体制片。本试验利用自然重力将染色体扩散分开，改进了传统的染色体压片法和火焰干燥法植物染色体制片技术，减少了操作程序，节约了时间和成本，提高了成功率。有关植物染色体滴片方法的报道有王幼平[5]的试验，但其并没有说明移液枪和载玻片之间的高度及具体的操作过程。本试验中的滴片高度是否科学合理也还有待进一步验证。

参考文献：

[1] 杨汉民.细胞生物学实验[M].北京：高等教育出版社，1997.208.

[2] 陈 高，孙 航，孙卫邦.改进的植物染色体制片方法[J].植物生理学通讯，2007，43（4）：759-760.

[3] 陈 磊，管长志，尹立荣，等.一种改进的胡萝卜染色体制片方法[J].天津农业科学，2009，15（2）：12-13.

[4] 洪培培，杨建玉，陈洪伟，等.一串红染色体制片技术优化与计数[J].西北植物学报，2011，31（10）：2124-2128.

[5] 王幼平.植物染色体制片方法的改进[J].生物学通报，2007，42（10）：55.