RP—HPLC法同时测定舒胸颗粒中3种皂苷类成分的含量

符传山+洪挺+王笑琴

[摘要] 目的 建立RP-HPLC法同时测定舒胸颗粒中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的含量测定方法。 方法 采用色谱柱Diamosil C18（4.6×250mm，5μm），柱温30℃，流动相乙腈-水，梯度洗脱，检测波长203nm。 结果 3个皂苷类成分色谱峰面积与对照品进样量均呈良好的线性关系，r≥0.9993；样品加样回收率在98.9%～99.7%之间，RSD均小于1.4%。 结论 该方法灵敏度高、专属性好、操作简便、重复性好，可为舒胸颗粒质量控制提供依据。

[关键词] RP-HPLC；舒胸颗粒；三七皂苷R1；人参皂苷Rg1；人参皂苷Rb1

[中图分类号] R286.0 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）13-33-03

[Abstract] Objective To establish a method for the simultaneous determining of notoginsenoside R1， ginsenoside Rg1 and ginsenoside Rb1 in Shuxiong Granules by RP-HPLC. Methods The RP-HPLC analysis was performed on a Diamosil C18 （4.6×250 mm，5μm）， the mobile phase was acetonitrile and water with gradient elution. The detection wave length was 203nm and the coumn temperature was 30℃. Results There was a good linear relationship between the peak area and the sample quantity for the three saponins， r≥0.9993. The recovery was between 98.9%-99.7% with RSD<1.4%. Conclusion The method has the advantage of sensitivity， specificity， simple operation， and repeatability. It is suitable for the quality control of Shuxiong Granules.

[Key words] RP-HPLC； Shuxiong granules； Notoginsenoside R1； Ginsenoside Rg1； Ginsenoside Rb1

舒胸颗粒由三七、红花、川芎3味药制成，主要用于瘀血阻滞所致的胸痹，症见胸闷、心前区刺痛；冠心病心绞痛。本品种原标准[1-2]分别收载于国家药品标准新药转正标准第27册和第37册，均采用薄层扫描法测定君药三七中人参皂苷Rg1的含量。由于三七中含有皂苷类成分较多，仅控制人参皂苷Rg1的含量不够全面，而且薄层扫描法的重现性不好。为有效控制药品质量，保证临床用药安全有效，经查阅文献 [3-6]，研究建立RP-HPLC法同时测定舒胸颗粒中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量测定方法。其质量标准被《中国药典》2015年版一部[7]收录。

1 仪器与试药

美国沃特斯2695 alliance高效液相色谱仪，配备四元泵、紫外检测器、柱温箱、高精度自动进样器、Empower数据采集处理工作站；德国Sartorius BP211D电子天平；Milli-Q超纯水机；昆山KQ-5200B型超声波仪（昆山市超声仪器有限公司）。

人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1对照品，均由中国药品生物制品检定所提供，含量测定用，批号分别为110703-200424、110704-200318、110745-200414；乙腈为色谱纯，水为自制超纯水，其他试剂均为分析纯；舒胸颗粒样品7批分别由A公司（规格：每袋装3g，批号为 080603、080903、080802、080902）、B公司（规格：每袋装1g，批号为070501、070502、070503）提供。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 混合对照品溶液的配制 分别称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成质量浓度为2.21、1.72、1.04 mg/mL的对照品储备液。分别精密量取一定体积的对照品储备液，加甲醇稀释成0.221、0.172、0.104 mg/mL混合对照品溶液，摇匀，备用。

2.1.2 样品溶液的配制 取舒胸颗粒适量，研细，取粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，静置12h，然后于80℃水浴上加热回流2h，放冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，取上清液用微孔滤膜（0.22μm）滤过，续滤液备用。

2.1.3 阴性对照溶液的配制 按处方量称取红花、川芎2味药，照舒胸颗粒生产工艺制备阴性对照样品。取阴性对照样品适量，照“2.1.2”项下方法制备阴性对照溶液，备用。

2.2 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱为Diamosil C18柱（4.6×250mm，5μm），柱温为30℃，检测波长为203nm，流速为1.0mL/min，进样量为20μL。流动相A为乙腈，流动相B为水，按表1进行梯度洗脱；理论塔板数按三七皂苷R1峰计算，应不低于3000。结果显示三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1保留时间分别约为29.4、32.9、56.9min，与其他组分峰的分离度大于1.5，陰性对照样品在相应保留时间处无干扰。结果见图1。

2.3 方法學考察

2.3.1 线性关系 取“2.1.1”项下混合对照品溶液2、5、10、20、30、50μL，注入液相仪，照上述色谱条件进行分析测定。以每个对照品进样量（μg）为横坐标，以相应的峰面积为纵坐标，拟合标准曲线。结果表明均呈良好的线性关系，线性方程、线性范围、相关系数见表2。

2.3.2 精密度实验 精密吸取混合对照品溶液，按照上述色谱条件，进样20μL，连续进样6次，记录各色谱峰的峰面积。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1峰面积的RSD分别为0.66%、0.54%和0.56%（n=6），均符合精密度实验要求。

2.3.3 重复性实验 取批号070501舒胸颗粒样品，研细，取粉末0.5g，共6份，精密称定，照“2.1.2”项下方法制成样品溶液，进样20μL。结果样品中三七皂苷R1 ，人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的平均含量分别为3.19mg/g、14.0mg/g、10.9mg/g，RSD分别为1.2%、1.0%、1.5%，结果表明该方法重现性良好。

2.3.4 稳定性实验 取批号070501舒胸颗粒样品溶液，室温下放置，分别于0，4，8，12，16 h重复进样，记录色谱峰面积。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1峰面积RSD分别为1.3%、0.39%、0.78%。数据说明该样品溶液在室温下放置16h所测成分稳定性良好。

2.3.5 回收率实验 取批号070501舒胸颗粒样品，研细，取粉末0.25g，共6份，精密称定，分别精密加入混合对照品溶液（三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1浓度分别为0.0400、0.0328、0.0268mg/mL）50mL，照“2.1.2”项下方法制备样品溶液并进行分析测定，计算加样回收率，结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1平均回收率为99.7%、98.9%、99.0%，RSD为1.3%、1.1%、1.0%。数据表明该方法回收率较好。

2.3.6 样品测定 取7批舒胸颗粒，照“2.1.2”项下方法制备样品溶液，按上述色谱条件进行分析测定，计算三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的含量，结果见表3。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

采用紫外分光光度计对混合对照品溶液进行光谱测定，结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的紫外光谱均属末端吸收，且在203nm处有最大吸收，因此选择203nm为测定波长。

3.2 提取方式的优化

目前测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1含量的方法，文献报道主要有HPLC法[8-15]和TLC扫描法，但未见同时测定舒胸颗粒中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1三个成分的文献报道。本研究对样品溶液的提取方法进行了热回流和超声提取的考察，结果表明：热回流法比超声处理法所测含量更大，说明其提取更完全，故选择热回流提取；本研究还对提取时间进行了考察，分别考察了热回流1、2、3h的提取情况，结果表明：热回流2h三种皂苷含量最高，3h与2h无差别，这说明2h已经提取较为完全，为节约时间，提高效率，故选择提取2h；另外，本研究还对提取溶剂进行了考察，分别采用甲醇、乙醇、50%甲醇三种溶剂进行实验，结果表明：甲醇提取三种皂苷含量最高，其提取最为完全，故最终确定甲醇为提取溶剂。

3.3 耐用性实验

取供试品溶液，分别采用A： DIKMA Diamonsil C18柱（4.6×250mm，5μm）；B： Alltech Apollo C18柱（4.6×250mm，5μm）；C： Agilent Zorbax SB-C18柱（4.6×150mm，5μm）三种不同品牌和填料的色谱柱进行测定，结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1峰在各种色谱柱上均分离良好，结果无明显差异，该方法耐用性良好。

本实验采用反相高效液相色谱法测定舒胸颗粒中3种皂苷的含量，方法学考察结果表明，该方法精密度、准确度、重复性均能满足定量分析要求，对评价舒胸颗粒质量标准提供了参考依据。

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（收稿日期：2017-01-07）