无脊椎动物先天免疫分子研究概述

刘文杰

(福建省厦门市大同中学 361009)

章跃陵

(广东汕头大学理学院生物学系/广东省海洋生物技术重点实验室 515063)

无脊椎动物的先天防御体系是在长期自然选择过程中进化形成的，非常有效且功能强大，其生物学意义已被广泛认识。无脊椎动物先天免疫系统与哺乳动物的先天免疫系统有很高的同源性，其相关研究成果可以为理解更复杂的高等动物免疫反应提供线索。此外，随着耐药性细菌的出现和传统抗生素治疗作用的下降，亟需寻找新型抗致病菌的活性物质。因此，关于无脊椎动物的先天免疫分子的研究是一个热点。

1 无脊椎动物先天免疫分子

一般认为，无脊椎动物缺乏真正的抗体和特异性的免疫细胞，机体防御反应依靠非特异性的先天免疫，与之相关的先天免疫分子是免疫反应系统的一个重要组成部分。

1.1 酚氧化酶 酚氧化酶(PO)是生物体内一类含铜氧化酶，能通过氧化酚或多酚形成对应的醌，大体可分为酪氨酸酶、儿茶酚氧化酶和漆酶三大类(后二者统称为多酚氧化酶)。无脊椎动物的多酚氧化酶常以酶原的形式存在，其活性位点由一个保守的苯丙氨酸占据并阻挡底物进入，不具有酶活性，需要时经过特异丝氨酸蛋白酶的切割形成有活性的PO才能起作用。

昆虫多酚氧化酶是一种非常重要的免疫蛋白，可同时介导体液和细胞有关成分参与免疫，是诱发黑化反应的主要酶，对于防止病原微生物入侵以及伤口愈合至关重要。依靠多酚氧化酶的免疫作用，昆虫可以在发病前清除大部分病原物，若多酚氧化酶的活性消失或被有效抑制后，昆虫对病原物的抵抗力显著下降[1]。漆酶型PO是海洋无脊椎动物免疫应答系统的重要组成部分，其氧化产物通常具有窄谱抗菌活性，且对弧菌有强烈的杀伤抑制作用，但与昆虫漆酶型PO在氧化产物抗菌谱上的差异显著。此外，漆酶型PO自身可通过多种方式有效应答病毒、细菌和真菌的入侵，对病原的刺激非常敏感、应答迅速，在无脊椎动物免疫力调控和病害预警中显示出潜在的应用价值[2]。

1.2 凝集素 凝集素(lectin)是无脊椎动物先天免疫系统的重要组分，存在于细胞外基质以及血淋巴细胞表面、细胞基质等处。凝集素也广泛分布于动物、植物和微生物中。凝集素是一类对特定细胞多糖具有结合亲和力的、多价构型的热敏蛋白或糖蛋白复合物，能选择性凝集脊椎动物血细胞、微生物细胞和单细胞藻类以及沉淀某些复杂碳水化合物。因此，可凝集外来病原菌、进行非己识别、调理和介导血细胞吞噬，在免疫应答早期阶段发挥着积极的作用。

软体动物中的凝集素在识别异体、凝集和吞噬等方面发挥着重要作用，如栉孔扇贝(Chlamysfarreri) 的血淋巴细胞内有多种含量丰富的凝集素，可凝集大肠杆菌等，并在细胞介导的吞噬作用中起协同作用[3]。文蛤(Meretrixmeretrix)在受到细菌刺激后，C-型凝集素基因表达量显著上升, 并参与对微生物入侵的免疫应答, 有助于提高文蛤等的免疫防御能力[4]。对几种棘皮动物凝集素的研究发现，它们在进行调理作用和创伤修复等防御机制中起重要作用。例如，拟球海胆(Paracentrotuslividus) 红细胞凝集素可能参与凝血作用、创面修复作用、调理作用和包囊作用，刺瓜参(Cucumariaechinata) 中C型凝集素可溶解兔和人的红细胞，并可能对外来微生物产生毒性等[5]。

1.3 抗菌肽 抗菌肽(AMPs)是无脊椎动物天然免疫系统的主要成分之一，是高效、具有广谱抗微生物(细菌和真菌)的活性小分子多肽，一般由12～100个氨基酸残基组成，具有亲脂、亲水性(双亲性)。抗菌肽的抗菌机制与传统抗生素截然不同，特点是分子量小、水溶性好、耐热性强、无免疫原性、杀菌速度快和不易被蛋白酶水解等，在无脊椎动物防御病原微生物中起着重要作用，被誉为“天然抗生素”。自Boman等发现第一个抗菌肽——天蚕素以来, 人们相继又从细菌、真菌、高等植物、昆虫、两栖类、哺乳动物甚至人体中发现具有类似性质的活性多肽。据统计，截止到2012年9月已确定的抗菌肽数量达到2032种，并且数据还在不断增加中。

现有研究结果显示，抗菌肽除了具有广谱抗菌活性外，还具有抗病毒和寄生虫等活性，以及趋化和免疫调节、中和毒素、抗肿瘤、促进血管生成和创伤修复等生物学功能[6]。

1.4 血蓝蛋白 血蓝蛋白(hemocyanin)是一种与呼吸作用有关的含铜蛋白，其特点是脱氧状态为无色，结合氧时呈蓝色，存在于节肢动物和软体动物的血淋巴中。通常认为血蓝蛋白的主要生物学功能与机体内的氧运输有关，故与血红蛋白、蚯蚓血红蛋白合称为动物界的三大呼吸蛋白。但近年来的研究表明，血蓝蛋白还是无脊椎动物中的一种具有多种免疫学活性的非特异性免疫分子，可以识别和抵抗病毒、细菌、真菌、异种动物红细胞及肿瘤细胞等多种病原体。血蓝蛋白及其亚基不仅在胰蛋白酶、甲壳动物血细胞溶解产物等激活下表现出酚氧化酶免疫功能, 而且其自身或裂解产生的不同分子质量大小的片段也可以抵御病毒的入侵，具备抗菌活性[7]。例如，对虾血蓝蛋白对鱼、鸡、鼠和人的红细胞以及对副溶血性弧菌、大肠杆菌K12和金黄色葡萄球菌呈现明显的凝集活性[8]。此外，血蓝蛋白还与能量的贮存、渗透压的维持以及蜕皮过程的调节有关[9]。

1.5 补体系统 补体系统是由一系列40多种蛋白质分子所组成、有着精密调控机制的蛋白质反应系统。补体作为众多免疫效应机制中的一员，在免疫过程的末端和吞噬作用以及炎症反应等一起发挥着作用，是连接先天免疫和适应性免疫的枢纽[10]。

Tagawa 等研究发现中国鲎中TtCRP-1、TL-5A、TL-1 和TPL-1分子可以召集C3和B因子的复合物到革兰氏阳性菌和酵母表面形成C3转化酶，进而催化更多的C3分子结合到这些微生物表面，同时还发现一个未知的C因子参与其中，提示其可能存在不同于脊椎动物的补体激活途径[11]。彭茂潇等[12]对无脊椎动物补体系统中已报道的C1q、MBL、ficolin等的成分、功能、激活途径和系统进化情况进行了较详尽的比较，现有的结果表明无脊椎动物可能存在与脊椎动物差异较大的补体系统，这预示着海洋无脊椎动物具有更多特有的补体激活途径。

1.6 纤维蛋白原相关蛋白 纤维蛋白原相关蛋白(FREPs)是含有纤维蛋白原相关结构域的凝集素家族，其典型分子结构是在N-末端含有1个或2个免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域，接着是1个调节区，在C-末端含有纤维蛋白原(FBG)结构域,具有“非己”识别能力,并能激活免疫应答[13]。研究表明:按蚊中的FREPs-FBN9既能与革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌相互作用，还能强烈凝聚位于蚊子肠上皮细胞中的啮齿动物或人的疟原虫，该结果提示FREPs具有防御活性并能与病原体直接作用。FBN9也可以形成二聚体，并能以不同的亲和力结合到细菌的表面。研究还发现，通过体外表达扇贝、文昌鱼等的FREPs能凝集人的A、B、O型血的红细胞和鸡红细胞，这种有钙依赖性的凝集可被乙酰基含水化合物特异性阻断，并且这些重组蛋白在有钙离子的条件下还能让革兰氏阳性金黄色葡萄球菌以及革兰氏阴性大肠埃希菌等细菌凝集[14]。因此，FREPs被认为是参与免疫防御最重要的分子之一，在无脊椎动物先天免疫中起着重要作用[15]。

2 无脊椎动物先天免疫系统的模式识别受体

无脊椎动物先天免疫系统作为外源物入侵后宿主防御的最重要防线，首先必须能够识别“异己”分子，进而快速激活体内相应的信号通路，产生各种效应分子来杀灭、清除外源物。无脊椎动物能够识别在微生物表面保守的、而在宿主中又不存在的病原相关分子模式(PAMPs)，如细菌脂多糖(LPS)、肽聚糖(PG)、细菌DNA及这些生物大分子的衍生物等，识别这些分子模式的受体统称为模式识别受体(PRRs)。这些PRRs的共同特征是配体的不专一性：一种模式识别受体可以引起不同的免疫防御反应，它们的性质和功能不尽相同(表1)[16]。

表1 模式识别受体的性质与功能

研究发现，当PAMPs被识别后，这些受体引发激活丝氨酸蛋白酶和解除丝氨酸蛋白酶抑制剂的细胞外级联反应，将受到感染的信号放大或解除错误信号(即信号的调整和放大过程),然后引发信号转导途径，激活目的基因的转录，最终激活效应物反应系统，产生抗菌肽、酚氧化酶等效应物[17]。PRRs还可以作为促进吞噬的调理素，也可以是凝集、黑化或其他蛋白质修饰级联反应等免疫过程的起始因子。