黄芪保心汤对心肌缺血大鼠的血流动力学和凋亡作用的研究*
2017-08-16潘勇军方邦江俞志刚王佑华曹
潘勇军方邦江俞志刚王佑华曹 敏△
(1.鄂东医疗集团市中医医院 ,湖北 黄石 435000;2.上海中医药大学附属龙华医院,上海200000)
·研究报告·
黄芪保心汤对心肌缺血大鼠的血流动力学和凋亡作用的研究*
潘勇军1方邦江2俞志刚2王佑华2曹 敏2△
(1.鄂东医疗集团市中医医院 ,湖北 黄石 435000;2.上海中医药大学附属龙华医院,上海200000)
目的观察黄芪保心汤对冠状动脉结扎大鼠的血流动力学、凋亡及Bax、Bcl-2,Caspase-3蛋白表达的影响。方法雄性SD大鼠48只,随机分为空白组、假手术组、模型组、黄芪保心汤组,除空白组、假手术组外,结扎冠状动脉造成大鼠心肌缺血损伤模型,假手术组只开胸不结扎,各组予相应药物干预4周后,观察黄芪保心汤对冠状动脉结扎大鼠心肌缺血血流动力学、左室质量指数、心肌细胞凋亡以及Bax、Bcl-2,Caspase-3蛋白表达。结果黄芪保心汤能改善心肌缺血大鼠血流动力学、减少凋亡、降低Bax、Caspase-3水平,升高Bcl-2水平,具有显著差异(P<0.05或P<0.01)。结论黄芪保心汤具有良好的抗心肌缺血作用,其作用机理与减轻心肌细胞凋亡,降低Bax、Caspase-3表达,升高Bcl-2表达相关。
黄芪保心汤 血流动力学 凋亡
冠状动脉粥样硬化性心脏病是由于冠状动脉血管发生病变而引起血管腔狭窄或者阻塞,造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病,是危害人们健康的常见疾病,而心肌缺血是其常见类型。尽管现代医学在改善血供、缓解心绞痛方面取得了长足的进展,但如何预防心肌缺血的发生、发展,仍缺乏有效对策,中医中药在防治心绞痛方面有一定优势。本课题组在辨证论治的基础上,运用黄芪保心汤干预心绞痛,取得良好的效果[1-2]。本实验在前期研究基础上,进一步探讨黄芪保心汤对心肌缺血大鼠血流动力学以及凋亡的影响。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物
SD雄性大鼠48只,SPF级,体质量(230±20)g,动物许可证号:SCXY(京)2012-001。由上海中医药大学附属龙华医院实验动物中心提供,饲养环境:室温22~24℃,相对湿度50%~60%,12 h/12 h明暗,自由进水和进食,6只/笼饲养。
1.2 试药与仪器
黄芪保心汤(黄芪30 g,丹参15 g,蒲黄12 g,水蛭12 g,白芥子15 g等药物。药材煎煮后,制得含生药含量相当于1.5 g/mL的药液备用)、凋亡试剂盒(南京建成生物工程有限公司)、戊巴比妥钠(中国医药集团上海化学试剂公司),配成3%水溶液。Powerlab 8导电生理记录仪 (AD Instrument)、DH-150型动物人工呼吸机(浙江大学医学仪器厂)。
1.3 模型制备
将48只SD大鼠随机分为4组,即黄芪保心汤组、空白组、假手术组、模型组,每组12只。除空白组外,其余各组大鼠均进行心肌缺血模型制备,具体操作步骤如下:以3%戊巴比妥钠行腹腔麻醉,剂量为45mg/kg,麻醉后予18号针行气管插管,连接呼吸机,参数设置为潮气量20~22mL/min,吸呼比为1∶2。然后于SD大鼠胸骨左侧剃毛,剑突上约1.0 cm,旁开约0.5 cm切开皮肤,分离皮下组织、肌肉,剪断第3根肋骨,剥离心包膜,暴露心脏,于左心耳下方约1~2mm,0/5号线结扎冠状动脉左前降支,宽度为0.1~0.2 cm,深度0.1 cm左右,心尖部心肌呈灰白色为模型制备成功标志。缝合胸腔,饲养1周后予相应药物干预,假手术组只穿线不接扎。
1.4 给药方法
黄芪保心汤组以黄芪保心汤1mL/100 g灌胃,而空白组、假手术组和模型组均以1mL/100 g生理盐水灌胃,各组大鼠每日给药1次,共4周。
1.5 标本采集与检测
1.5.1 血流动力学变化 将大鼠麻醉进行气管切开术并给予机械通气,分离右侧颈总动脉并做一切口,将连接PowerLab数据分析处理系统的PE-50聚乙烯管插入颈动脉,逐步进入左心室,检测左室内压最大上升速率(+dP/dtmax)、左室内压最大下降速率 (-dP/dtmax)、左室收缩压(LVSP)、左室舒张末期压力(LVEDP)。
1.5.2 左室质量指数 处死大鼠,摘取心脏,置于生理盐水中漂洗去血液,剪去血管、左右心房、右心室及左右心耳,分别称取各组SD大鼠左心室质量(LVW)并记录,并计算左心室质量(LVW)/体质量(BW)比值,此即为左心质量指数(LVMI),计算出左心质量指数后,将心肌组织采用4%中性甲醛固定。
1.5.3 TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数 取出固定的心肌组织,予梯度酒精脱水后,取左心室中部矢状面切片,切片厚度约为5μm,石蜡包埋 ,然后进行TUNEL法染色,记录每个视野染色阳性细胞数,阳性细胞所占百分比即为凋亡指数,计算各组病理切片凋亡指数。
1.5.4 Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白表达 采用Western blot法,具体步骤简述如下:将提取好的心肌组织蛋白样品与上样缓冲液混合,煮沸后进行SDS-PAGE电泳,蛋白转膜后,分别加入 Bax、Caspase-3、Bcl-2一抗孵育过夜,完成二抗孵育后进行显示处理,分析光密度,最终结果以Bax、Caspase-3、Bcl-2和β-actin的光密度比值表示。
1.6 统计学处理
2 结 果
2.1 各组大鼠一般情况比较
实验大鼠共48只,因手术意外死亡的有3只(结扎后严重心律失常或灌流过程中死亡),死亡率为6.25%。其中空白组、假手术组无死亡,模型组1只,死亡率为8.33%,黄芪保心汤组2只,死亡率为16.67%。2.2 各组大鼠血流动力学变化比较
见表1。各组大鼠心率无明显差异(P>0.05),与空白组、假手术组相比,模型组及黄芪保心汤组+dp/dt、-dp/dt、LVSP、LVEDP均有明显差异(P<0.01),而空白组与假手术组比较无明显差异(P>0.05),与模型组相比,黄芪保心汤组差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
表1 各组大鼠血流动力学变化比较(±s)
表1 各组大鼠血流动力学变化比较(±s)
与空白组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01;与假手术组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,★P<0.05,★★P<0.01。下同。
组 别HR(BPM) +dp/dtmax(mmHg/s) -dp/dtmax(mmHg/s)LVSP(mmHg)LVEDP(mmHg)空白组假手术组模型组340.72±36.58 4176.34±713.62 -3011.47±506.53 348.42±43.21 3946.52±682.77 -2901.35±561.79 352.35±54.26 2531.68±702.54▲▲**-2126.62±479.78▲▲**135.85±11.74 20.12±6.34 130.67±11.24 22.36±5.94 120.34±8.57▲▲**10.85±3.747▲▲**黄芪保心汤组347.62±39.87 3154.72±602.39▲▲**★★-2545.32±520.83▲▲**★★128.44±9.2▲▲**★16.42±6.08▲▲**★★
2.3 各组大鼠左心室质量指数比较
见表2。各组大鼠体质量无明显差异(P>0.05),模型组左室质量高于空白组和假手术组(P<0.05),其余各组无明显差异 (P>0.05),模型组左心室质量指数(LVWI=LVW/BW)高于空白组、假手术组和黄芪保心汤组(P<0.05或P<0.01)。
表2 各组大鼠心肌细胞左心室质量指数比较(±s)
表2 各组大鼠心肌细胞左心室质量指数比较(±s)
组别BW(g) LVW(g) LVWI(mg/g)空白组假手术组模型组369.48±35.52 0.85±0.07 2.30±0.19 355.64±41.39 0.82±0.08 2.31±0.22 337.00±37.94 1.06±0.12▲*3.15±0.29▲▲**黄芪保心汤组362.42±38.74 0.96±0.08 2.65±0.16▲*★
2.4 各组大鼠心肌细胞凋亡情况比较
见表3。空白组与假手术组无显著差异 (P> 0.05),模型组、黄芪保心汤组明显高于空白组和假手术组(P<0.05或P<0.01),模型组高于黄芪保心汤组(P<0.05或P<0.01)。
表3 各组大鼠心肌组织凋亡指数比较(±s)
表3 各组大鼠心肌组织凋亡指数比较(±s)
组别 凋亡指数(%)空白组假手术组模型组3.62±0.75 3.41±0.67 23.46±6.43▲▲**黄芪保心汤组12.54±3.65▲▲**★★
2.5 各组大鼠心肌组织Bax、Bcl-2、Caspase-3表达水平比较
见表4。Bax空白组与假手术组无显著差异(P>0.05),模型组、黄芪保心汤组组明显高于空白组和假手术组(P<0.01),模型组高于黄芪保心汤组(P<0.01)。Bcl-2黄芪保心汤组明显高于空白组、假手术组和模型组(P<0.01),空白组、假手术组和模型组3组之间无明显差异 (P>0.05)。Caspase-3模型组明显高于空白组、假手术组和黄芪保心汤组(P<0.01),空白组、假手术组和黄芪保心汤组3组之间无明显差异(P>0.05)。
表4 各组大鼠心肌组织Bax、Bcl-2,Caspase-3表达水平比较(±s)
表4 各组大鼠心肌组织Bax、Bcl-2,Caspase-3表达水平比较(±s)
组别Bax Bcl-2 Caspase-3空白组假手术组模型组0.36±0.05 0.68±0.09 0.32±0.02 0.41±0.07 0.59±0.07 0.39±0.03 0.84±0.13▲▲**0.66±0.11 0.69±0.08▲▲**黄芪保心汤组0.67±0.11▲▲**★★1.56±0.25▲▲**★★0.37±0.03★★
图1 各组Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白电泳图
3 讨 论
细胞凋亡是在细胞外部因素刺激下由基因调控的主动性死亡过程,目前认为心肌细胞凋亡参与心肌缺血过程,心肌细胞凋亡是心肌缺血损伤的重要形式[3-7],因此干预心肌细胞凋亡对缺血损伤中心肌细胞的保护具有重要的作用。凋亡的发生与基因调节有关,凋亡基因与抗凋亡基因的相互协调作用决定了凋亡的启动或抑制,常见的与凋亡有关的调控基因有Bcl-2、Bax和 Caspase-3基因。Bcl-2主要分布在线粒体外膜,Bcl-2高表达可抑制内质网释放,阻止超氧化物的产生和作用,可以调节膜通透性,抑制细胞凋亡;Bax基因与Bcl-2基因具有高度的同源序列,二者可相互结合形成结合体,当Bax高表达时,其可与Bcl-2结合形成异二聚体,抑制Bcl-2活性,改变线粒体膜的通透性,引起线粒体损伤,促进凋亡[8]。Caspase作为一种特异天冬氨酸的半胱氨酸蛋白酶,在细胞凋亡信号途径中居于重要位置,Caspase可通过死亡受体途径、线粒体途径和内质网介导的凋亡通路,参与凋亡过程。Caspase-3是Caspase家族中重要的亚型,Caspase-3表达增加、刺激激活是凋亡信号传导通路中的重要环节,是参与调节和执行细胞凋亡最重要的蛋白酶之一[9-10]。
黄芪保心汤由黄芪、生蒲黄、水蛭、丹参、白芥子等药物组成,方中黄芪大补元气,用以为君,实取“气为血之帅,气行则血行”之意。蒲黄、水蛭能行血祛瘀,丹参活血通脉,白芥子“能搜剔胁下及表里膜外之痰”,诸药合用,共奏益气活血、祛痰化浊之功效。前期研究表明,黄芪保心汤能显著提高缺血心肌中降钙素基因相关肽水平、清除自由基,改善心肌缺血后血管内皮损伤,减轻缺血心肌超微结构损伤,尤其是线粒体肿结构损伤,从而起到保护心肌的作用[11-14]。且黄芪保心汤中之黄芪能改善心肌能量代谢,增强心肌收缩力,改善心肌缺血[15]。本实验通过冠状动脉结扎造成心肌缺血模型,从血流动力学、病理学以及生物化学角度上综合评价黄芪保心汤对大鼠心肌缺血的保护作用,结果显示,黄芪保心汤可改善心肌缺血大鼠+dp/dt、-dp/dt、LVSP、LVEDP,从而改善血流动力学;黄芪保心汤能够降低心肌缺血大鼠左室质量指数,减少心肌细胞凋亡,其减少凋亡机制可能与降低心肌缺血大鼠心肌组织Bax、Caspase-3蛋白表达,增加Bcl-2蛋白表达相关。
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Effect of Astragalus Heart-Protecting Decoction (AHPD)on Hemodynam ic and Apoptosis in M yocardial Ischem ia Rats
PAN Yongjun,FANG Bangjiang,YU Zhigang,et al.Chinese Medicine Hospital of HubeiMed-ical Group,Hubei,Huangshi435000,China.
Objective:To investigate the effect of AHPD on hemodynamic,apoptosis and expression of Bcl-2,Bax and Caspase-3 inmyocardial ischemia induced by ligation of coronary artery(LCA).M ethods:48 male SD rats were randomly divided into four groups:the blank group,the sham operation group,the model group and AHPD group.Except the blank group and the sham operation group,myocardial ischemia injury model was induced by ligation of coronary artery in rats.In the sham operation group,only thoracotomy was not performed.The effects of AHPD on myocardial ischemia,hemodynamics,left ventricular mass index,myocardial cell apoptosis,and expression of Bax,Bcl-2 and Caspase-3 proteins in coronary artery ligated rats were observed 4 weeks after corresponding drug intervention.Results:AHPD could improve the hemodynamics,reduce apoptosis,decrease the levels of Bax and Caspase-3,and increase the level of Bcl-2 in ratswithmyocardial ischemia,which had significant difference(P<0.05,or P<0.01).Conclusion:AHPD has a good effect on anti-myocardial-ischemia,and its mechanism is related to the reduce ofmyocardial apoptosis and the expression of BAX and Caspase-3,and the increase of the expression of Bcl-2.
Astragalus Heart-Protecting Decoction;Hemodynamic;Apoptosis
R285.5
A
1004-745X(2017)07-1175-04
10.3969/j.issn.1004-745X.2017.07.013
2017-04-25)
上海中医药大学中西医结合高原学科面上项目
△通信作者(电子邮箱:28679028@qq.com)