超声波辅助提取藜麦多糖及其抑菌性与抗氧化性

徐澜+郭晨晨+赵慧

摘要：为明确不同产地（山西省偏关县、静乐县）藜麦种子的多糖提取率及其抑菌性、抗氧化性之间的差异，以蒸馏水为提取剂采用超声波法辅助提取藜麦多糖，滤纸片法测定抑菌活性；采用消除DPPH自由基法测定水提多糖的抗氧化活性，并用维生素C作阳性对照。结果表明：藜麦种子在料液比为1 g ∶[KG-*3]10 mL时多糖提取率最高，且偏关县藜麦的多糖提取率（2 094.5 μg/g）显著高于静乐县藜麦的多糖提取率（1 781.5 μg/g）。藜麦多糖对DPPH自由基有清除能力，且随着多糖质量浓度的增加而呈现增大趋势。藜麦多糖对大肠杆菌有较强抑菌效果，但对金黄色葡萄球菌抑菌性较弱。

关键词：藜麦；多糖；纸片扩散法；抑菌性；抗氧化性

中图分类号： R282.2文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）11-0143-03[HS）][HT9.SS]

藜麦（Chenopodium quinoa Willd）是一年生的藜科双子叶草本作物，原产于南美洲安迪斯山区。藜麦中含有大量的优质蛋白，且含量与肉类含量相当，含有全部8种人体必需氨基酸[1]。除此之外，藜麦中含有丰富的淀粉、脂肪、矿物质元素、维生素等。因此，藜麦被联合国粮农组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，简称FAO）认为是唯一一种单体植物就能满足人体基本营养需求的全类谷物[2]。藜麦有均衡营养、修复体质、增强机体功能、调节免疫和内分系统的作用，而且具有预防疾病、抗癌、抗衰老及抗氧化的功效，因此藜麦是减肥美容、减少人类慢性病的“功能食品”的优秀代表。

作为生命四大基本物质之一的高分子聚合物多糖，由醛基和酮基通过苷键连接，是动物、植物、微生物细胞的重要组成成分，具有抗肿瘤、抗氧化、抗凝血、免疫調节、降血糖和抗病毒等重要功能[3]，因此，从很多动植物中都可以提取到多糖，近几年关于多糖的提取及其作用的报道也越来越多。目前为止，已有研究者利用不同方法对红豆、木瓜、银杏叶、枸杞、黄芪等提取了多糖，并研究它们的抑菌性及抗氧化性[4-8]。结果表明，红豆多糖和木瓜多糖有抗氧化活性，枸杞多糖、黄芪多糖和水溶性大豆多糖有抑菌效果。藜麦中含有的多糖、多酚、黄酮等活性物质，具有很好的体外抗氧化活性和抑菌性。目前关于藜麦多糖提取方面的研究极少，未见关于藜麦多糖的抗氧化性及抑菌性的相关研究报道。

超声波辅助提取固体样品，利用超声波作用液体时产生的空化作用和机械振动作用，使溶液内产生气泡，增长并爆破压缩，导致细胞壁结构破裂[8]。它是物理粉碎过程，伴随产生热效应和乳化作用，提高固体中多糖的提取率，具有节能、提取率高、节省提取时间的优点；但如果温度过高，渗出的杂质也会增多，因此温度不宜过高[9]。目前关于超声辅助提取技术已成功应用于提取木瓜多糖、银杏叶多糖等，但超声辅助提取藜麦多糖的研究较少见。本试验采用超声波辅助提取藜麦多糖，研究其抗氧化性和抑菌性，对于藜麦在功能食品、化妆品、医药、生物农药研发中的应用提供参考，并为藜麦天然抗氧化剂的开发提供依据。

1材料与方法

1.1材料与主要仪器

市售2个产地的藜麦种子（山西省忻州市偏关县、静乐县）；DPPH（1，1-二苯基-2-苦肼基）：由西安沃尔森生物技术有限公司提供；试验用水为蒸馏水。供试菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，均由忻州师范学院生物系微生物实验室提供。UV-2102C型紫外可见分光光度计，由上海仪电分析仪器有限公司提供；YXQ-LS-75G型立式压力蒸汽灭菌锅，由上海云泰仪器仪表有限公司提供；Supcre系列菌落计数/筛选/抑菌圈测量联用仪，由杭州迅数科技有限公司提供。

1.2试验方法

1.2.1藜麦多糖的制备

原材料预处理：分别挑选市售偏关县和静乐县2地藜麦中颗粒饱满的种子，置于50 ℃烘箱中烘干至恒质量，粉碎后过40目筛，密封备用。脱脂[5]：分别称取偏关县和静乐县的藜麦粉各5份，每份0.2 g，置于离心管中。向其中各加入2 mL石油醚，静置过夜，4 000 r/min离心 10 min，弃去上清液。除单糖和低聚糖：向已经脱脂的藜麦中加入2 mL 95%乙醇，静置过夜，4 000 r/min离心10 min，弃去上清夜。将沉淀放在烘箱中，50 ℃烘干。

1.2.2多糖的提取

根据试验设计，采用超声波辅助提取藜麦多糖。按照1 ∶[KG-*3]5、1 ∶[KG-*3]10、1 ∶[KG-*3]15、1 ∶[KG-*3]20、1 ∶[KG-*3]25等5个不同的料液比（g ∶[KG-*3]mL），向各离心管中加入蒸馏水。在超声功率 320 W、温度50 ℃的条件下浸提40 min，提取藜麦多糖。浸提结束后4 000 r/min离心10 min，倒出滤液至另一离心管中，舍弃沉淀。向离心管中加入4倍体积的的95%乙醇，放置4 ℃冰箱中醇沉24 h，4 000 r/min离心10 min，收集沉淀。沉淀依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤，真空干燥，得到粗多糖。

1.2.3脱蛋白

粗多糖用5 mL蒸馏水溶解，向其中加入Sevage试剂1.2 mL[Sevage试剂：取100 mL三氯甲烷，向其中加入20 mL正丁醇，混匀，放入棕色瓶，备用。（Sevage法除蛋白：V多糖溶液 ∶[KG-*3]V氯仿 ∶[KG-*3]V正丁醇=25 ∶[KG-*3]5 ∶[KG-*3]1）][10]，混合物用微型漩涡混合仪剧烈振荡20 min，4 000 r/min离心10 min。小心取出上层多糖溶液，弃去下层有机相和中间蛋白沉淀。

1.2.4醇沉

按照参考文献[4]的方法进行醇沉，得到精制多糖。将提取的多糖用2 mL蒸馏水溶解得多糖溶液，放置于冰箱中冷藏备用。

1.2.5试验设计

根据不同料液比提取的藜麦多糖质量浓度结果，采用多糖提取率最高的料液比，按照上述方法，分别提取2 g偏关县和静乐县藜麦多糖。并用20 mL蒸馏水溶解，制成多糖溶液，放置于冰箱中冷藏备用。

1.2.6标准曲线的制备精确称取105 ℃干燥至质量不变的葡萄糖对照品10 mg，加入蒸馏水定容至100 mL，得到 0.1 mg/mL 的葡萄糖标准溶液。分别吸取此溶液0、0.1、02、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL带塞试管中，蒸馏水定容至1 mL，加入5 mL现配的蒽酮-硫酸试剂，充分摇匀，盖塞，在沸水浴中15 min，取出后立即用冷水冷却至室温。用0号管调零，在620 nm波长下分别测得D620 nm。以D620 nm为纵坐标，葡萄糖质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.7藜麦多糖抗氧化作用测定方法

DPPH溶液的配制[6]：准确称取50 mg DPPH，用无水乙醇定容到100 mL，使DPPH的终浓度为0.5 mg/mL。取10 mL 0.5 mg/mL的 DPPH 溶液，用无水乙醇定容到100 mL，使DPPH的终浓度为0.05 mg/mL。将配好的DPPH溶液置于棕色瓶中，放置冰箱中，待用。

采用维生素C作阳性对照，将配制好的0.01 mg/mL的维生素C标准液置于棕色瓶中，放置冰箱中待用。

抗氧化能力的测定：分别吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL 维生素C标准液，用蒸馏水定容到2 mL，加入浓度为0.05 mg/mL的DPPH 2 mL，充分混匀，放置到黑暗的地方，静置30 min左右，测定其在517 nm的吸光度D1。同时测定 2 mL DPPH溶液与2 mL蒸馏水混匀静置30 min后的吸光度D0；以及在2 mL蒸馏水中加入0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL维生素C标准液，用蒸馏水定容至4 mL充分振荡摇匀后的吸光度D2。以浓度确定的维生素C标准液的体积数为横坐标，以DPPH·的清除率为纵坐标作图。

DPPH·的消除率计算公式为：

[JZ]Y=[1-（D1-D2）/D0]×100%。

采用上述方法[4]对偏关县和静乐县的藜麦多糖提取液进行抗氧化能力的测定。

1.2.8藜麦多糖的抑菌作用

供试菌种的活化[11]：连续3次将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌进行培养基斜面活化，采用试管牛肉膏蛋白胨固体作为培养基，第3次的菌体备用。菌悬液的制备[12]：用无菌接种环挑取少量活化的供试菌于无菌生理水中，用移液枪轻轻吹打使菌体分散，稀释摇匀，用显微镜直接计数法计数，制成106～107 CFU/mL的菌悬液，待用。圆滤纸片的准备：用打孔器将滤纸裁制成直徑大小为6 mm的圆滤纸片，121 ℃高温蒸汽灭菌30 min、干燥 30 min。

测定藜麦多糖提取液的抑菌性：在无菌操作台中，将经过灭菌的培养基倒入培养皿内10～15 mL，室温下凝固，记号笔标记相应的菌体及不同产地的藜麦多糖。夹取经高温蒸汽灭菌的圆滤纸片浸泡于藜麦多糖溶液中20 min，备用。用移液枪吸取 200 μL 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的菌悬液至相应平板上，用无菌涂布器涂布均匀。采用滤纸片扩散法，用无菌镊子夹取含多糖溶液滤片平放于平板表面，每个板放置5个滤纸片，均匀分散在平板上。将各平板倒置在37 ℃生化培养箱中培养6～8 h，观察其生长情况，用Supcre系列菌落计数/筛选/抑菌圈测量联用仪记录各平板抑菌圈直径，求平均值。

1.3数据处理

采用料液比为1 g ∶[KG-*3]10 mL时的藜麦多糖提取率，应用Excel 2003对藜麦多糖提取率作图，DPS 7.05统计分析数据的差异显著性。

2结果与分析

2.1多糖质量浓度的测定

2.1.1标准曲线的绘制

取7支具塞试管，按浓度梯度配制葡萄糖溶液，以D620 nm值为纵坐标，葡萄糖质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。用最小二乘法得线性回归方程：y=0.006 69x+0.029 2，r2=0.991 09。根据方程，可计算样品中多糖质量浓度（图1）。

2.1.2样品中多糖提取率的测定

由图2、图3可知，超声波辅助提取藜麦多糖，在超声波功率为320 W、温度为50 ℃、提取时间为40 min的条件下，在料液比接近1 g ∶[KG-*3]10 mL时，偏关县和静乐县的藜麦多糖提取率均为最高，且偏关县的藜麦多糖提取率显著高于静乐的多糖提取率（表1）。因此，在相同提取条件下，本试验选取1 g ∶[KG-*3]10 mL的料液比提取偏关县和静乐县的藜麦各 2 g，得到精制多糖溶液。

2.2抗氧化作用的测定

2.2.1维生素C对DPPH·的清除能力由图4可知，随着维生素C标准液的体积的增加（0～2 mL），即随着维生素C浓度的增加，维生素C标准液对DPPH·的清除率亦增强，且维生素C对DPPH·的清除作用较明显。表明抗氧化剂维生素C作为阳性对照有良好的清除能力，即有良好的抗氧化性。

2.2.2样品对DPPH·的清除能力由图4、图5、图6可知，藜麦多糖和维生素C对DPPH·的清除率趋势相同，清除率随维生素C标准液、藜麦多糖提取液样品体积的增加而增强。偏关县、静乐县的藜麦多糖对DPPH·的清除率都随着多糖溶液体积（0～2 mL）的增加而增强，对DPPH·清除率的趋势基本相同。但由于偏关县的藜麦多糖提取率（2 094.5 μg/g）高于静乐县的藜麦多糖提取率（1 781.5 μg/g），因此同体积多糖提取液相比较，偏关县藜麦多糖对DPPH·的清除率高于静乐县藜麦多糖。

2.3抑菌作用的测定

由表2可知，偏关县的藜麦多糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌现象，但对大肠杆菌的抑菌作用较强，对金黄色葡萄球菌抑菌作用较弱。静乐县藜麦多糖对大肠杆菌有抑菌现象，但对金黄色葡萄球菌无抑菌现象。[FL）]

3结论与讨论

本研究表明，偏关县、静乐县2地藜麦多糖的提取率分别为 2 094.5、1 781.5 μg/g，均远低于文献[3]中0.16 g/g的藜麦多糖提取率。分析原因，首先是提取获得的目标多糖不同，袁俊杰等提取的是粗制多糖[3]，而本试验为逐级除杂后中提取的精制多糖；其次是前人以預处理后的藜麦质量作为分母，计算多糖提取率，而本试验以处理之前的藜麦质量计算多糖提取率；此外，不同试验设备以及操作过程中损失程度不同；除品种自身差异外，以上因素是造成藜麦多糖提取率差异较大的原因。研究表明，藜麦种子多糖得率在品种间存在明显差异[3]，这与本试验中不同产地的藜麦种子多糖提取率存在差异结果一致，可见藜麦多糖含量不仅与品种遗传有关，也与生态环境、栽培条件有关。

不同产地的藜麦多糖均具有一定抗氧化能力，这与前人有关红豆多糖、木瓜多糖等的研究结果一致。本试验中偏关县的藜麦多糖提取率大于静乐县藜麦多糖提取率，2地藜麦多糖对DPPH·的清除能力表现为相同趋势，[JP2]即偏关县的藜麦多糖清除DPPH·的能力较强，表现出的抗氧化能力也较强。藜麦多糖和维生素C对DPPH·的清除率趋势相同。藜麦多糖具有抑菌作用，与文献[11]结果基本一致。偏关县产地的藜麦多糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌现象，但静乐县产地的藜麦多糖仅对大肠杆菌有抑菌现象，对金黄色葡萄球菌无抑菌现象。这可能与静乐县产地的藜麦多糖提取率低于偏关县产地的藜麦多糖提取率有关。有关不同产地、生态环境、栽培条件对藜麦种子营养成分及其抑菌性、抗氧化性的具体影响，有待进一步进行更加精确、系统的对比研究。[JP]

藜麦种子在料液比为1 g ∶[KG-*3]10 mL时多糖提取率最高，且偏关县藜麦的多糖提取率（2 094.5 μg/g）显著高于静乐县藜麦的多糖提取率（1 781.5 μg/g）。藜麦多糖对DPPH自由基有清除能力，且清除率随着多糖体积的增加而呈现增大趋势。藜麦多糖对大肠杆菌有较强抑菌效果，但对金黄色葡萄球菌抑菌性较弱。

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