不同冻结方式对高白鲑肌原纤维蛋白理化特性和功能特性的影响

高泽磊+张建

摘要：为了研究不同冻结方式对高白鲑肌原纤维蛋白理化特性和功能特性的影响，取高白鲑背部肌肉，一部分置于普通冷柜-18、-24 ℃冻藏5周，另一部分利用液氮快速冷冻的方法置于-18、-24 ℃温度下，利用FeCl3/H2O2/Asc氧化系统模拟对高白鲑肌原纤维蛋白的氧化，每隔1周测定鱼肉理化指标及功能性指标的变化情况。结果表明：高白鲑在4种温度条件下冻藏1～5周后，羰基含量和表面疏水性含量上升，总巯基含量和游离氨含量下降，氮溶性指数降低，乳化性及乳化稳定性下降，起泡性降低，蛋白质发生不同程度的氧化。贮藏的温度越低，防止蛋白质氧化的效果越好。利用液氮快速冷冻的方法有助于高白鲑的贮藏保鲜，提高鱼肉品质。可见，不同的冻结方式对高白鲑肌原纤维蛋白理化特性和功能特性有显著影响，液氮快速冷冻的方法可有效提高鱼肉品质。

关键词：高白鲑；冻结方式；蛋白质氧化；肌原纤维蛋白；液氮速冻

中图分类号： TS254.4文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）11-0129-06[HS）][HT9.SS]

高白鲑是一种高好氧性冷水鱼类，肉味鲜美，无肌间刺，生长迅速，是新疆冷水鱼中的一大重要产业。目前低温冷冻贮藏是高白鲑主要的保存方式之一，这种方式可以使原料中酶的活性、脂肪和蛋白质的氧化速率、微生物的生长代谢等都受到一定程度抑制。研究发现，冻肉品质的变化与冻藏条件有密切关系。国内外关于冻藏对水产品品质的影响研究较多，主要集中在不同冻藏条件下水产品的生化、功能特性以及加工特性的变化规律[1-6]。通常情况下，肉类品质随着冻藏时间的延长而逐渐劣变。冻藏过程中，组成肉的各种化学成分之间会发生一系列复杂的物理、生物、化学变化，如蛋白质聚集变性、脂肪氧化、腐败变质等。通常在相同温度下畜肉冻藏的时间较长，禽肉和水产品的冻藏时间则相对较短，因为禽肉和水产品中易被氧化的不饱和脂肪酸含量相对较多[7-11]。但由于高白鲑肉质鲜嫩，极易受蛋白质氧化的影响，因此普通的低温贮藏会造成鱼肉品质的下降。

液氮是将空气中的氮气液化，得到无色、无味、透明、微溶于水的液体，化学性质稳定，而且无毒、无刺激性。美国最先将液氮应用于速冻食品，目前已广泛应用于虾、银鱼、蟹及鲍鱼等水产品的速冻[12-15]。研究表明，液氮速冻处理的水产品可以保持较高的鲜度、味道和色度，而且可以杀死部分细菌，达到较高的卫生要求[16-18]。因此，本试验利用液氮快速冷冻的方法，通过测定肌原纤维蛋白理化特性和功能特性来考察高白鲑肌肉蛋白氧化的情况，以期为高白鲑的贮藏保鲜提供依据。

1材料与方法

1.1材料与仪器

高白鲑鱼（质量1 000～1 500 g，体长30～35 cm）由新疆赛湖渔业科技开发有限公司提供。氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、2，4-二硝基苯肼、乙酸乙酯、乙醇、盐酸胍、三氯乙酸、β-巯基乙醇、甘氨酸等均为分析纯。

主要仪器：85-1磁力搅拌器（江苏金坛市医疗仪器厂）、BL-206-Ⅱ高速冷冻离心机（金坛市恒丰仪器厂）、BS210S精密电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）、DK-8B电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）、PHS-3CpH计（上海精密科学仪器有限公司）、Mini-protein Ⅲ紫外可见分光光度计（美国Bio-Rad公司）、T80冷冻食品中心温度计（深圳市拓尔为电子科技有限公司）。

1.2试验方法

1.2.1原料处理

将高白鲑鱼解剖，用刀将鱼脊背肌肉分割成大小均匀的肉块（15 g），随机取一部分分成4份，按照以下条件进行冷冻处理：（1）-18 ℃普通冷柜冷冻（以下温度均按照中心温度计算）；（2）-24 ℃普通冷柜冷冻；（3）-18 ℃液氮快速冷冻；（4）-24 ℃液氮快速冷冻。分别包装、封口，经1、2、3、4、5周冻藏后，在每个处理组中随机取3份，定期测定理化指标和功能性指标。

1.2.2肌原纤维蛋白的提取

鱼背部肌肉中的肌原纤维蛋白的提取参考Chin等的方法[19]并适当修改，提取液分别为磷酸盐缓冲液A（50 mmol/L Na2HPO4、50 mmol/L NaH2PO4，pH=7.5），8 000 r/min，15 min，4 ℃条件下提取2次，弃去上清液，保留沉淀，再用磷酸盐缓冲液B（50 mmol/L Na2HPO4、50 mmol/L NaH2PO4，0.6 mol/L NaCl，pH=7.5），5 000 r/min、15 min、4 ℃条件下提取2次，合并为上清液，即为肌原纤维蛋白。

1.2.3FeCl3/H2O2/Asc氧化系统

参照田童童等报道的方法[20]采用羟基自由基氧化体系（hydroxyl radical-generating system，简称为HRGS），即由0.1 mmol/L FeCl3，0.1 mmol/L维生素C和20 mmol/L H2O2组成。将提取的肌原纤维蛋白溶解在含有以上氧化体系的50 mmol/L磷酸盐缓冲液中（pH=6.0），使蛋白的最终浓度为20 mg/mL。然后将样品放置在4 ℃下 5 h，使高白鲑鱼肌原纤维蛋白发生不同程度的氧化。通过添加丁基羟基茴香醚/水溶性维生素E/乙二胺四乙酸（butyk hydroxy anisd/trolox/ethylene diamine tetraacetic acid，简称BHA/Trolox/EDTA）使其最终浓度为1 mmol/L，中止氧化反应，氧化产物经过磷酸盐缓冲液洗涤和离心处理去掉上清液，得到的沉淀用于测定理化和功能性指标。

1.3羰基含量的测定方法

参照Oliver等的方法[21]并加以改动，取5 mL的蛋白样品溶液放進离心管中，每管中加入5 mL 10 mmol/L的2，4-二硝基苯肼（2，4-dinitrophenylhydrazine，简称DNPH），室温下反应1 h（每10 min涡旋振荡1次）后，添加5 mL 20% 三氯乙酸（trichiloro acetic acid，简称TCA），8 000 r/min离心 5 min，弃清液，用5 mL体积比为1 ∶[KG-*3]1的无水乙醇和乙酸乙酯混合溶液清洗沉淀3次，除去多余的试剂，再向沉淀中加入3 mL 6 mol/L 酸胍溶液后置于水浴锅中（37 ℃，15 min），将沉淀溶解，8 000 r/min离心5 min除去不溶物质，取离心后的上清液用紫外分光光度计在370 nm处测吸光度。使用摩尔消光系数22 000 L/（mol·cm）计算羰基含量。

1.4总巯基含量的测定方法

参照di Simplicio等的方法[22]并加以改动，方法如下：取1 mL的蛋白样品溶液，加入8 mL的三羟甲基氨基甲烷（Tris）-甘氨酸（pH=8，每升该溶液中含有10.4 g Tris、69 g甘氨酸、1.2 g EDTA、8 mol/L尿素），然后经均质，8 000 r/min 离心 15 min，除去不溶蛋白，在溶液中加入 0.5 mL 10 mmol/L Ellman试剂，反应0.5 h后，用紫外可见分光光度计在412 nm处测定吸光度，使用摩尔消光系数 13 600 L/（mol·cm） 计算总巯基含量，采用Biuret法测定蛋白质的含量。参照组除了不加蛋白溶液处，其他处理方法均如上所述。

1.5游离氨含量的测定方法

参照Brands等的方法[23]并加以改动，准确称取40 mg的邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde，简称OPA），溶解于1 mL的甲醇中，分别加入2.5 mL 20%的十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，简称SDS）、25 mL 0.1 mol/L的硼砂、100 μL β-巯基乙醇后用蒸馏水定容到50 mL。将200 μL蛋白样品液分别注入到含有4 mL空白液和4 mL OPA试剂的试管中，两者混合均匀后在35 ℃条件下反应2 min，在340 nm下测吸光度D340 nm，二者之差ΔD340 nm为游离氨基的净吸光度。氧化蛋白的吸光度与未氧化蛋白的吸光度相比所占百分比为游离氨的相对含量，计算公式如下，用游离氨基的相对含量进行作图。

[JZ]游离氨相对含量=[SX（]ΔD340 nmD未氧化[SX）]×100%。

1.6表面疏水性的测定方法

参照Chelh等的方法[24]并加以改动，取1 mL的蛋白样品溶液，加入200 μL 1 mg/mL的溴酚蓝（bromophenol blue，简称BPB），混匀，室温下搅拌10 min，然后8 000 r/min离心 15 min，取上清液在595 nm下测定吸光度，记作D595 nm。溴酚蓝空白样是用1 mL 20 mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH=6.0）加200 μL溴酚蓝，磷酸盐缓冲液作空白样，在595 nm下测定吸光度，记作D0。计算公式如下：

[JZ]溴酚蓝（μg）=[SX（]200 μg×（D0-D595 nm）D0[SX）]。

1.7氮溶性指数的测定方法

称取10 mL蛋白样品分散于10 mL的蒸馏水中，使用磁力搅拌器搅拌30 min，接着用1 mol/L NaOH或HCl溶液调节溶液的pH值至7.0，搅拌30 min后，4 ℃离心（8 000r/min，20 min）。采用双缩脲法测定蛋白质的含量，以牛血清蛋白为标准蛋白，制作标准曲线。蛋白质的氮溶性指数用上清液蛋白浓度（mg/mL）占总蛋白浓度（mg/mL）的百分比表示。氮溶性指数（nitrogen solubility index，简称NSI）的计算公式：

[JZ]NSI=[SX（]上清液中的蛋白含量（mg/mL）樣品中总蛋白含量（mg/mL）[SX）]×100%。

1.8乳化性及乳化稳定性的测定方法

取大豆油和蛋白溶液按体积比1 ∶[KG-*3]4放入50 mL的塑料离心管中，使其混合均匀，然后从距离心管底部0.5 cm的位置取50 μL（剩余的混合液备用）混合均匀的溶液，放入到含有5 mL 0.1%十二烷基硫酸钠溶液中，使用漩涡振荡器使其混匀后用紫外可见分光光度计在500 nm处测定吸光度，记作D1；匀浆后10 min再次在相同位置取匀浆液50 μL，加入到 5 mL 0.1%十二烷基硫酸钠溶液中，振荡混匀后测定吸光度，记作D2，用0.1%十二烷基硫酸钠溶液作空白对照。肌肉蛋白匀浆液的乳化性（emulsifying activity index，简称EAI）和乳化稳定性（emulsifying stability index，简称ESI），分别由下面公式来表示：

[JZ]EAI（m2/g）=[SX（]2×2.303C×（1-Φ）×104[SX）]×D1×L；ESI=[SX（]D2D1[SX）]×100%。

式中：L表示比色杯光径，1 cm；Φ表示油相体积分数（Φ=02）；C表示蛋白质浓度；D1表示乳状液在0 min的吸光度；D2表示乳状液在10 min的吸光度。

1.9起泡性的测定方法

在室温25 ℃下，取20 mL的肌肉蛋白溶液，磁力搅拌 30 min，取10 mL（V0）溶液于50 mL塑料量筒中，高速匀浆机搅打1 min，立刻读取泡沫的总体积（V1）。肌肉蛋白的起泡性Fc由下面公式来表示：

[JZ]Fc=[SX（]V1-V0V0[SX）]×100%。

1.10数据处理

数据分析及作图分别采用SPSS 17.0、Origin 8.0软件，所有试验至少重复3次。

2结果与分析

2.1不同冻结方式对高白鲑肌原纤维蛋白羰基含量的影响

蛋白质发生氧化以后，醛基和酮基反应生成羰基。羰基的含量是反映蛋白质被氧化程度的重要指标。由图1可知，贮藏4周时，-18 ℃、-24 ℃普通冷柜，-18 ℃、-24 ℃液氮速冷4组处理的样品羰基含量分别为7.405、7.392、6.392、5.824 nmol/mg；冻藏5周时羰基含量分别达到8.271、8.181、7.838、6.324 nmol/mg。说明4种冷冻方式下，液氮冷冻比普通冷柜防止蛋白质氧化的效果要好，液氮速冷可以更有效地防止蛋白质氧化，但是试验过程中发现，使用液氮快速冷冻时，必须及时控制速冷时间，否则会造成样品严重的冻伤；同时贮藏温度对防止蛋白质氧化造成高白鲑肌肉劣变有明显影响，经-24 ℃普通冷柜贮藏后肌原纤维蛋白质中的羰基含量要比-18 ℃普通冷柜贮藏的低；-24 ℃液氮速冷也比 -18 ℃ 液氮速冷的蛋白质羰基含量低。

[HTK]2.2不同冻结方式对高白鲑肌原纤维蛋白总巯基含量的影响[HT]

由图2可知，经不同冷冻方式下高白鲑肌原纤维蛋白中的总巯基含量随着贮藏时间的延长而降低。-18 ℃普通冷柜冻藏1周高白鲑肌原纤维蛋白总巯基的含量是 64.26 μmol/mg，经过2、3、4、5周冻藏后，总巯基的含量下降到50.18、30.72、26.52、14.37 μmol/mg，分别下降21.91%、52.19%、58.73%、77.64%；-24 ℃普通冷柜经过2、3、4、5周冻藏后，高白鲑肌原纤维蛋白总巯基含量由 69.41 μmol/mg 分别下降20.21%、45.37%、59.88%、76.42%；-18 ℃液氮冷冻经过2、3、4、5周冻藏后，高白鲑肌原纤维蛋白总巯基含量由74.78 μmol/mg分别下降 30.82%、48.01%、63.47%、79.38%；-24 ℃液氮冷冻经过2、3、4、5周冻藏后，高白鲑肌原纤维蛋白总巯基含量由 78.29 μmol/mg 分别下降26.73%、41.60%、62.66%、76.09%。总巯基含量的降低代表蛋白质发生了变性，或者由于分子间的二硫键发生聚集，或者受到了氧化。Lund等指出，巯基含量的降低一定程度上代表了蛋白氧化的程度[25]。

[HTK]2.3不同冻结方式对高白鲑肌原纤维蛋白游离氨含量的影响[HT]

由图3可知，经不同冷冻方式下高白鲑肌原纤维蛋白中的游离氨含量随着贮藏时间的延长而降低。与冷藏后1周相比，-18 ℃普通冷柜冻藏2、3、4、5周后，高白鲑肌原纤维蛋白中游离氨的相对含量分别下降14.43、21.65、29.90、35.05百分点；-24 ℃普通冷柜经过2、3、4、5周冻藏后，高白鲑肌原纤维蛋白中游离氨的相对含量分别下降11.22、19.39、2347、29.59百分点；-18 ℃液氮冷冻经过2、3、4、5周冻藏后，高白鲑肌原纤维蛋白中游离氨的相对含量分别下降[JP2]1066、15.74、19.80、26.90百分点；-24 ℃液氮冷冻经过2、3、4、5周冻藏后，高白鲑肌原纤维蛋白中游离氨含量分别下降606、1313、18.18、20.20百分点。游离氨相对含量的降低可能是由于侧链的—NH或—NH2氨基酸参与了羰基的形成。[JP]

[HTK]2.4不同冻结方式对高白鲑肌原纤维蛋白表面疏水性的影响[HT]

蛋白质表面疏水性反映了蛋白质分子表面疏水性氨基酸的相对含量，一般来说，它通常用来衡量蛋白质的变性程度。由于它能反映出蛋白位点在化学或物理上的微妙变化，所以疏水性被作为评价蛋白变性的一个重要参数[26]。从图4中可看出，不同的冷冻方式对高白鲑肌原纤维蛋白的表面疏水性含量有明显的影响，液氮速冷相比普通冷柜更能抑制蛋白质[CM（25]表面疏水性含量的增加。-18[KG*3]℃普通冷柜冻藏2、3、4、5[CM）]

周后，高白鲑肌原纤维蛋白表面疏水性由 28.58 μg 分别增加到37.83、63.25、70.21、78.92 μg；-24 ℃普通冷柜经过2、3、4、5周冻藏后，高白鮭肌原纤维蛋白表面疏水性由24.21 μg分别增加到35.72、60.32、68.72、73.32 μg；-18 ℃液氮冷冻经过2、3、4、5周冻藏后，高白鲑肌原纤维蛋白表面疏水性由[JP2]26.63 μg分别增加到31.93、50.25、62.13、70.35 μg；-24 ℃液氮冷冻经过2、3、4、5周冻藏后，高白鲑肌原纤维蛋白表面疏水性由27.28 μg分别增加到30.82、48.73、5625、67.45 μg。[JP]

[HTK]2.5不同冻结方式对高白鲑肌原纤维蛋白氮溶性指数的影响[HT]

一般蛋白质溶解程度的强弱用氮溶性指数的大小来反映。从图5中可以看出，随着贮藏时间的延长，高白鲑鱼肌原纤维蛋白氮溶性指数在不断下降。当贮藏时间为4周时，-18 ℃、-24 ℃普通冷柜和-18 ℃、-24 ℃液氮冷冻4组样品中肌原纤维蛋白的氮溶性指数较贮藏后1周分别下降2778%、24.00%、21.05%、21.52%；-18 ℃液氮冷冻相比-18 ℃普通冷柜冷冻条件下在冻藏1、2、3、4、5周后，氮溶性指数分别上升5.56%、2.82%、8.33%、15.38%、1304%；在-24 ℃液氮冷冻条件下，高白鲑经过1、2、3、4、5周贮藏后氮溶性指数与-24 ℃普通冷柜冷冻贮藏相比分别上升5.33%、4.17%、7.94%、8.77%、14.00%。说明利用液氮快速冷冻的方式可以延缓高白鲑鱼肌原纤维蛋白氮溶性指数的下降。

[HTK]2.6不同冻结方式对高白鲑肌原纤维蛋白乳化性及乳化稳定的影响[HT]

蛋白质氧化破坏蛋白质结构的稳定性，使蛋白质失去交联能力，造成蛋白质乳化活性和乳化稳定性的下降。从图6中可以看出，随着贮藏时间的延长，高白鲑鱼肌原纤维蛋白乳化性和乳化稳定性在不断下降。与贮藏后1周相比，当贮藏时间为4周时，-18 ℃、-24 ℃普通冷柜和-18 ℃、-24 ℃液氮冷冻4组样品中肌原纤维蛋白的乳化性分别下降1282%、11.39%、12.50%、8.54%，而乳化稳定性分别下降33.90%、31.15%、22.22%、21.54%；-18 ℃液氮冷冻与 -18 ℃ 普通冷柜冷冻条件下相比在冻藏1、2、3、4、5周后，乳化性分别上升2.56%、2.60%、2.74%、2.94%、6.25%，而乳化稳定性分别上升 6.78%、3.57%、23.81%、25.64%、2571%；在-24 ℃液氮冷冻条件下，高白鲑经过1、2、3、4、5周贮藏后乳化性与 -24 ℃ 普通冷柜冷冻贮藏相比分别上升3.80%、3.85%、541%、7.14%、7.69%，乳化稳定性分别上升6.56%、1.69%、12.5%、21.43%、12.20%。Lizarraga等认为，蛋白质和低分子量的表面活性剂是反映乳化特性和乳浊液稳定性的主要依据[27]。蛋白质受到不同程度的氧化，乳化特征也会发生相应程度的变化。[FL）]

[FL（2K2]2.7不同冻结方式对高白鲑肌原纤维蛋白起泡性的影响

由图7可知，随着贮藏时间的延长，高白鲑鱼肌原纤维蛋白起泡性在不断下降。当贮藏时间为4周时，-18 ℃、-24 ℃ 普通冷柜和-18 ℃、-24 ℃液氮冷冻4组样品中肌原纤维蛋白的起泡性分别下降40.00%、35.29%、33.33%、35.00%；-18 ℃液氮冷冻与-18 ℃普通冷柜冷冻条件下相比，在冻藏1、2、3、4、5周后，起泡性分别上升20.00%、4167%、40.00%、33.30%、25.00%；在-24 ℃液氮冷冻条件下，高白鲑经过1、2、3、4、5周贮藏后起泡性与-24 ℃普通冷柜冷冻贮藏相比分别上升17.65%、12.50%、15.38%、1818%、37.50%。起泡性的降低反映了蛋白质的溶解性和黏度下降，这与蛋白质的乳化性及乳化稳定性是相对应的，反映了蛋白质的变性程度。

2.8不同冻结方式下各指标之间的相关性分析

高白鲑肌原纤维蛋白在不同冻结方式下物化特性和功能性质之间的相关性分析如表1至表4所示。由表1至表4可知，各指标之间有着显著的相关性（P<0.05），大部分指标有极显著的相关性（P<0.01）。当样品在-18 ℃普通冷柜冷冻条件下，羰基含量与表面疏水性含量呈极显著正相关（相关系数为0.95），与其他指标呈极显著负相关；当样品在-24 ℃ 普通冷柜冷冻条件下，总巯基含量与羰基含量、疏水性[CM（25]含量呈极显著负相关（相关系数分别为-0.94、-0.99），[CM）]

与其他指标呈显著正相关；当样品在-18℃液氮快速冷冻条件下，表面疏水性含量与羰基含量呈极显著正相关（相关系数为0.92），与其他指标呈负相关；当样品在-24 ℃液氮快速冷冻条件下，所有指标之间均显示出了极显著的相关性（P<0.01）。因此，不同的冷冻条件下各指标之间的变化是相互联系的。[FL）]

3结论

在不同冻结方式下高白鲑肌原纤维蛋白的理化特性和功能特性都发生了明显变化，具体表现在随着贮藏时间的延长，羰基含量和表面疏水性含量增加，总巯基含量和游离氨含量逐渐下降，蛋白质起泡性和氮溶性指数不断降低，乳化性及乳[FL）]

[FL（2K2]化稳定性也呈下降趋势。采用-18 ℃、-24 ℃液氮速冷贮藏时，高白鲑肌原纤维蛋白质羰基和疏水性的含量明显比 -18 ℃、-24 ℃ 普通冷柜冷冻贮藏时含量低；而总巯基、游离氨、氮溶性指数、乳化性及乳化稳定性和起泡性明显要高于同温度下普通冷柜冷冻贮藏，说明液氮速冷的冻结方式对延缓蛋白质氧化具有一定作用；同時温度越低越有利于延缓高白鲑肌肉的劣变。由于蛋白质的理化特性改变会严重影响高白鲑的品质、营养风味及生产加工性能，所以在加工、贮藏和运输环节中考虑新型的冻结方式以及适当降低温度有利于提高高白鲑的品质。

[HS2*2][HT8.5H]参考文献：

[1]余小领，李学斌，闫利萍，等. 不同冻结和解冻速率对猪肉保水性和超微结构的影响[J]. 农业工程学报，2007，23（8）：261-265.

[2]周光宏. 肉品加工学[M]. 北京：中国农业出版社，2008：91-94.

[3]黄鸿兵，徐幸莲，周光宏. 冷冻贮藏对冻猪肉冰晶形态、TVB-N及TBARS的影响[J]. 食品工业科技，2008，29（2）：117-119，122.

[4]周爱梅，龚杰，邢彩云，等. 罗非鱼与鳙鱼鱼糜蛋白在冻藏中的生化及凝胶特性变化[J]. 华南农业大学学报，2005，26（3）：103-107.

[5]曾名勇，黄海，李八方. 鲫鱼（Camwfus awrartos）肌原纤维蛋白生化特性在冻藏过程中的变化[J]. 青岛海洋大学学报，2003，33（2）：192-198.

[6]Novelli E，Zanardi E，Ghiretti G P，et al. Lipid and cholesterol oxidation in frozen stored pork，salame Milano and mortadella[J]. Meat Science，1998，48（1/2）：29-40.

[7]Tironi V A，Tomás M C，Aón M C. Quality loss during the frozen storage of sea salmon （Pseudopercis semifasciata）. Effect of rosemary （Rosmarinus officinalis L.） extract[J]. LWT-Food Science and Technology，2010，43（2）：263-272.

[8]Stika J F，Xiong Y L，Suman S P，et al. Frozen storage stability of antioxidant-treated raw restructured beef steaks made from mature cows[J]. Meat Science，2007，77（4）：562-569.

[9]Sotelo C G，Gallardo J M，Pieiro C，et al. Trimethylamine oxide and derived compounds changes during frozen storage of hake （Merluccius merluccius）[J]. Food Chemistry，1995，53（1）：61-65.[ZK）]

[10]Selani M M，Contreras-Castillo C J，Shirahigue L D，et al. Wine industry residues extracts as natural antioxidants in raw and cooked chicken meat during frozen storage[J]. Meat Science，2011，88（3）：397-403.

[11]Benjakul S，Bauer F. Biochemical and physicochemical changes in catfish （Silurus glanis Lime） muscle as influenced by different freeze-thaw cycles[J]. Food Chemistry，2001，72（2）：207-217.

[12]張懋平. 液氮超速冻技术[J]. 制冷，1995（1）：22-27.

[13]方健. 液氮在食品工业上的应用[J]. 食品研究与开发，1990（2）：8-10.

[14]陈绍桥. 液氮在食品速冻中的应用[J]. 山东食品科技，2002（11）：36-37.

[15]张懋平. 液氮速冻技术的产生与发展[J]. 渔业机械仪器，1993，20（4）：22-25.

[16]张玉文，袁秀玲，钱鸿章. 深冷急冻技术冻结对虾的应用[J]. 深冷技术，1996（2）：42-43.

[17]卢定伟，陈年林，徐锡斌，等. 工业用液氮速冻银鱼试验及优化方案[J]. 低温工程，1999（4）：228-230.

[18]梁伟廉. 液氮速冻生物（蟹）的实验[J]. 深冷技术，1988（1）：48-50.

[19]Chin K B，Go M Y，Xiong Y L. Konjac flour improved textural and water retention properties of transglutaminase-mediated，heat-induced porcine myofibrillar protein gel：effect of salt level and transglutaminase incubation[J]. Meat Science，2009，81（3）：565-572.

[20]田童童，巩子路，朱新荣，等. 蛋白质氧化引起乳清蛋白理化性质变化的影响[J]. 江苏农业科学，2013，41（11）：301-303.

[21]Oliver C N，Ahn B W，Moerman E J，et al. Age-related changes in oxidized proteins[J]. Journal of Biological Chemistry，1987，262（12）：5488-5491.

[22]di Simplicio P，Cheeseman K H，Slater T F. The reactivity of the SH group of bovine serum albumin with free radicals[J]. Free Radical Research Commolunications，1991，14（4）：253-262.

[23]Brands C M J，van Boekel M A J S. Kinetic modeling of reactions in heated monosaccharide-casein systems[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50（23）：6725-6739.

[24]Chelh I，Gatellier P，Santé-Lhoutellier V. Technical note：a simplified procedure for myofibril hydrophobicity determination[J]. Meat Science，2006，74（4）：681-683.

[25]Lund M N，Hviid M S，Claudi-Magnussen C，et al. Effects of dietary soybean oil on lipid and protein oxidation in pork patties during chill storage[J]. Meat Science，2008，79（4）：727-733.

[26]Sante-Lhoutellier V，Aubry L，Gatellier P. Effect of oxidation on in vitro digestibility of skeletal muscle myofibrillar proteins[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55（13）：5343-5348.

[27]Lizarraga M S，Pan L G，Aon M C，et al. Stability of concentrated emulsions measured by optical and rheological methods. Effect of processing conditions—Ⅰ. Whey protein concentrate[J]. Food Hydrocolloids，2008，22（5）：868-878.[ZK）][HT][HJ][FL）]