中药消除致病性大肠杆菌耐药性的研究

2017-08-12韦嫔谭艾娟吕世明王学君

江苏农业科学 2017年11期

韦嫔谭艾娟吕世明王学君

摘要：为了解黄连、金银花、艾叶、鱼腥草和五倍子5种中药对猪源致病性大肠杆菌的抑菌效果以及对庆大霉素耐药性的消除情况，采用试管二倍稀释法测定5种中药的最小抑菌浓度，通过影印培养法筛选出耐药性消除菌落并计算其消除率。结果表明，除鱼腥草外，黄连、金银花、艾叶、五倍子表现出明显的抑菌效果，亚抑菌浓度的黄连、金银花、艾叶、五倍子作用24 h后对致病性大肠杆菌庆大霉素耐药性的消除率分别为5.34%、2.67%、10.01%、12.53%；作用 48 h 后其消除率分别为7.27%、3.47%、10.93%、13.68%。黄连、金银花、艾叶和五倍子能消除致病性大肠杆菌对庆大霉素的耐药性。

关键词：中药；致病性大肠杆菌；耐药性；消除

中图分类号： S852.61+2文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）11-0127-02[HS）][HT9.SS]

致病性大肠杆菌是兽医临床感染中最常见的病原菌之一，每年因其引起的疾病给养殖业造成了巨大的经济损失。为防治疾病，许多养殖场广泛且不规范地使用抗菌药物，导致细菌的耐药问题越来越严重，最后不得不通过加大用药剂量、增加药物种类来治疗大肠杆菌病，从而陷入“应用抗菌药物→耐药→加大剂量和种类→高度耐药和多重耐药→治疗无效和残留增加”的恶性循环，最终危及養殖业发展和人类健康。因此，[JP+1]如何解决细菌耐药性的问题成为人们关注的焦点，我国中药资源丰富，已有研究证实许多中药具有抗菌作用，且可以降低或消除细菌耐药性[1-2]。因此，本试验研究黄连、金银花等5种常见中药的抑菌效果以及对致病性大肠杆菌耐药性的消除，旨在筛选出对耐药致病性大肠杆菌具有强抑菌作用的中药，为中草药在临床上治疗由耐药性致病菌引起的传染性疾病和进一步进行中药逆转[JP]细菌耐药性研究提供参考依据。

1材料与方法

1.1试验药物及试剂

黄连、金银花、鱼腥草、艾叶、五倍子，购于西安海佳生物科技有限公司。卡那霉素（KAN）、庆大霉素（GEN）、氧氟沙星（OFL）、环丙沙星（CIP）、头孢唑林（CEF）、四环素（TET）、地美环素（DMCT）、磺胺嘧啶（SD），购于大连美仑生物技术有限公司。MH琼脂、伊红美兰琼脂和LB培养基，均购于上海博微生物科技有限公司；氯化钠（NaCl），分析纯，购于南汇彭德公社营房化工厂；十二烷基硫酸钠（SDS），分析纯，购于广东顺德化学生物研究所。

1.2试验菌株

采样于贵州省规模养猪场共5株，且经鉴定的致病性大肠杆菌EC1、EC2、EC3、EC4、EC5，由贵州大学药理实验室提供。它们对卡那霉素、庆大霉素、氧氟沙星、环丙沙星、头孢唑林、四环素、地美环素、磺胺嘧啶8种抗菌药物的MIC值见表1。大肠杆菌质控菌株ATCC25922，购于中国兽药监察所。

1.3中药药液的制备

将黄连、金银花、鱼腥草、艾叶、五倍子5种中药按刘玉庆等的方法[3]煎煮提取后浓缩药液，使各药液中生药含量均为 1 g/mL，110 ℃灭菌20 min，于4 ℃冰箱保存备用。

1.4中药提取液对致病性大肠杆菌MIC值的测定

采用改良的肉汤二倍稀释法[4-5]测定各中药药液对受试菌的最小抑菌浓度（MIC）。取11个灭菌离心管并编号，每管先加入无菌LB肉汤培养基2.0 mL，然后于第1个离心管加中药提取液2.0 mL，混匀后取出2.0 mL放入第2个离心管中，依次类推作倍比稀释，直至第9个离心管取出2.0 mL弃去，第10个离心管不加中药作为无药物空白对照，第11管不加药物和菌液做空白对照。取100 μL受试菌稀释液（菌液浓度为1×106 CFU/mL）分别加至1～10号离心管内，置于 37 ℃ 恒温培养箱中培养24 h，然后用无菌棉拭子分别蘸取各管内少量肉汤，涂布在LB固体培养基平板上，37 ℃再培养18～24 h。以平板上无细菌生长的最低药物浓度为该种中药对该菌株的最小抑菌浓度（MIC）。

1.5耐药性的消除试验

分别制备含中药的浓度为1/2 MIC的LB肉汤，再分别加入稀释好的菌液，37 ℃恒温培养24、48 h，同设不加药物的空白组和SDS对照组；然后再转种分离于LB固体培养基平板上，37 ℃恒温培养待长出单个菌落后，随机挑取300个菌落，按照影印培养法[6-7]用无菌牙签分别对应点种含庆大霉素的MH琼脂平板及不含药物的MH琼脂平板上，37 ℃培养18～24 h。

[HTK]1.6耐药性消除子的筛选与鉴定[HT]

挑取在含庆大霉素平板上不生长且在不含药物的平板上生长的菌落，在LB固体培养基上传代后，再接种于含庆大霉素平板上进行检测证实，即为消除子。根据耐药性消除菌落数与检测菌落总数之比，计算大肠杆菌耐药性消除率[8]。

2结果与分析

2.1耐药性的测定结果

在质控菌株ATCC25922对临床常用的8种抗菌药物均敏感的情况下，5株致病性大肠杆菌不仅对GEN耐药，还对KAN、TET、CEF、CIP、OFL、DMCT、SD都呈不同程度的耐药，致病性大肠杆菌的耐药情况比较严重。

2.3耐药性消除结果

由表3可知，5种中药中五倍子对菌株耐药性的平均消除率最高，作用24 h后，平均消除率为12.53%，其最高消除率可达22.33%；其他中药的消除率依次是艾叶10.01%、黄连5.34%、金银花2.67%；五倍子作用48 h后其平均消除率为13.68%，最高消除率可达24.41%，其他中药的消除率依次是艾叶10.93%、黄连7.27%、金银花3.47%，4种中药对致病性大肠杆菌庆大霉素耐药性的消除率均高于SDS对照组；未经药物处理的空白对照耐药菌株的耐药性自发消除率为0.00，说明细菌耐药性在短时间内自然丢失的概率极低。

3讨论

细菌的耐药性问题越来越受关注，本试验选取的5株致病性大肠杆菌对临床常用的8种抗菌药物全部耐药，这与兽医[CM（25]临床大量不合理使用药物密切相关。我国中药资源丰富血类中药，五倍子是敛肺涩肠类中药。本试验中，除鱼腥草外，其余4种中药均有较好的抑菌作用。对致病性大肠杆菌中药最小抑菌浓度的测定结果表明，黄连、金银花、艾叶和五倍子抑菌效果明显，但是不同中药对同1株细菌的最小抑菌浓度不同，抑菌效果也不同，这可能与中药含有的有效成分不同有关。五倍子、艾叶和黄连对临床大肠杆菌抑菌效果较强，这与黄玲等所报道的结果[9]一致；金银花在体外对致病性大肠杆菌有抑菌作用与陈希文等的报道[10]一致，却与刘荣欣等的报道结果[11]不同；鱼腥草在所配制的500 mg/mL浓度下无抑菌作用，这与杜银忠所报道的结果[12]一致。目前关于中药体外抑菌作用的研究报道较多，但报道结果之间有差异，产生这种差异可能与中药的产地、采收季节、提取方法和试验用的菌株等不同有关。

耐药性消除试验结果显示，五倍子、艾叶、黄连对临床致病性大肠杆菌耐药性具有较高的消除率，金银花的消除率相对较低，但均高于SDS对照组。不同的中药对致病性大肠杆菌耐药性的消除率有很大的差异，五倍子作用48 h后的平均消除率为13.68%，而金银花为3.47%，这可能是因为不同的中药含有不同的有效抑菌成分、各个中药成分具有不同的药理作用的原因。同种中药对不同菌株耐药性消除率也不同，具有较大的波动范围，黄连作用48 h后对EC1耐药性的消除率为3.33%，对EC2却为11.67%，这可能是由于不同的耐药菌株其对抗菌药物的耐药机制不同而引起的差异。对比中药作用24、48 h致病性大肠杆菌耐药性消除率的差异可以看出，作用时间直接影响着中药消除耐药性的效果，随着作用时间的延长，其消除率均有所提高，这是由于中药作用机理比较复杂，中药所含有的各种成分比较多，作用比较缓慢。阴性对照组的大肠杆菌耐药性消除率为0.00%，表明耐药致病性大肠杆菌其耐药性短时间内自然丢失的概率极低。许多中草药具有抑菌或抗菌作用，而且不易产生耐药性，毒副作用小。因此，筛选开发出抑菌效果好、耐药性消除率高的中草药，对于控制细菌耐药性的传播与中药的开发利用都具有十分重要的意义。但中药消除细菌耐药性的机制比较复杂，据目前报道主要是通过消除耐药质粒、影响外排泵、影响细胞膜和细胞壁

[HT][FL）]

[KH*4D]

等，具体作用机制还有待进一步研究。

参考文献：

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[2]孟甄，金建玲，刘玉庆，等. 细菌耐药性的诱导与消除[J]. 中国药理学通报，2003，19（9）：1047-1051.

[3]刘玉庆，李晔，车程川，等. 大肠杆菌对中草药敏感性试验及其方法研究[J]. 中兽医医药杂志，2003，22（1）：3-5.

[4]何湘蓉，王一然，李伟奇，等. 黄芩提取物对耐药性金黄色葡萄球菌的体外抑菌和耐药抑制作用研究[J]. 中兽医医药杂志，2012，31（3）：12-14.

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[7]王晓波. 中药黄连对耐药金葡菌抑制作用的研究[J]. 现代畜牧兽医，2007（10）：9-10.

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