资源植物玉叶金花果实多糖的提取工艺研究

赵玉立+程鑫+潘绒+黄京京+李发壮+胡晓倩

摘 要：采用醇沉水提法从资源植物玉叶金花果实中提取粗多糖，通过乙醚脱脂、Savage法脱蛋白得到精多糖。在单因素试验的基础上，采用L9（34）正交试验，探讨pH值、浸提时间、料液比、乙醇醇析体积倍数对玉叶金花果实中精多糖提取率的影响。结果表明，玉叶金花果实中精多糖的最佳提取工艺条件为料液比1∶15（g·mL-1），浸提时间3 h，pH值6，乙醇醇析体积倍数1∶4。在此提取工艺条件下，提取率为2.71%；通过验证此最佳提取工艺稳定可行。

关键词：资源植物；玉叶金花；多糖；单因素试验；正交试验

中图分类号：Q946.3 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.08.004

Abstract： The crude polysaccharide in the resource plant of Mussaenda esquirolli Lévl. fruit was extracted by alcohol-water extraction， and then the refined polysaccharide were got using degreasing of ether and eluting protein of Sevage reagent. Comparison of single-factor test and then using orthogonal test of L9 （34）， 4 factors such as pH， extraction time， liquid ratio， times the size of ethanol alcohol -precipitated to the refined polysaccharide extraction were studied with the extract yield for the evaluation. The results showed that the best conditions for extraction were extracting liquid than 1∶15（g·mL-1）， extraction time 3 h， pH 6， 4 times the size of ethanol alcohol-precipitated. Under this extraction process conditions， extract yield was 2.71%， the optimum extraction process was stable and feasible.

Key words： resource plant； Mussaenda esquirolli Lévl.； polysaccharide； single-factor test； orthogonal test

玉叶金花（Mussaenda esquirolli Lévl.），又名白纸扇、野白纸扇、白叶子、凉藤子、大凉藤、小凉藤，属茜草科（Rubiaceae）玉叶金花属（MussaendaLinn）[1]。玉叶金花的花期在每年的 4—8月，可长达 100 d以上。开花时，叶状雪白的萼片及金黄色的花冠显现在树冠上，颜色鲜艳而奇美；玉叶金花枝条细软，既可作造型盆景，也可作建筑的垂直绿化，极具观赏价值。玉叶金花的茎、叶、根、藤均可入药，味甘、淡、凉，具有清热解暑、凉血解毒的功效[2-4]。由玉叶金花制成的保健茶，短期饮用具有润肠舒胃、提高免疫力、预防流感等功效，长期饮用可以保持身体健康，促进微循环。另外，玉叶金花在绿化环境、净化空气、涵养水源、保持水土、改善生态环境等方面极具生态价值。因此，玉叶金花是具有观赏、药用、保健和生态等多种价值的資源植物。

多糖是由超过10 个以上、通常由几百甚至几千个单糖分子聚合而成的一类化合物，由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成，糖苷键分为α型和β型2 种。近年来，由于植物多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、降血糖等多种生物活性，且具有毒副作用小、不易造成残留等优点[5-6]，对植物多糖的研究呈现逐渐增多的趋势。但目前，对植物多糖的研究多集中在药理作用等方面，而对植物多糖进一步的分离纯化、结构测定、结构和功能关系及在食品、农业、工业方面的开发应用等研究较少。

有研究表明，玉叶金花叶、茎主要含有豆甾醇、β-谷甾醇、三萜酸类阿江酸、苏索酸、咖啡酸、对-羟基桂皮酸、阿魏酸、山栀子苷甲酯等活性成分[7]，但对玉叶金花的活性成分多糖研究甚少，尤其是对玉叶金花果实中多糖的提取及功能的研究还未见报道。

本研究在单因素试验的基础上，采用正交试验，优化玉叶金花果实多糖的提取工艺，旨在为资源植物玉叶金花的深入综合开发提供参考数据。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 试验材料 玉叶金花果实采自黄山市屯溪区黄山学院南校区，由黄山学院生命与环境科学学院张慧冲副教授鉴定。

1.1.2 试剂及仪器设备 95%乙醇、无水乙醇、无水乙醚、三氯甲烷、正丁醇、葡萄糖、浓硫酸、蒽酮、氢氧化钠、盐酸等，均为国产分析纯。

HH-S数显恒温水浴锅（江苏省金坛市医疗仪器厂），TDL-5台式低速离心机（上海安亭科学仪器厂），R-201旋转蒸发器（上海申胜生物技术有限公司），SHZ-IIID循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂），BCD-171D容声电冰箱（广东科龙电器股份有限公司），YP3001N电子天平（上海精密科学仪器有限公司），PL203电子精密天平（梅特勒-托利仪器上海有限公司），DGX-9073B-2电热鼓风干燥箱（上海福玛实验设备有限公司），UV754紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。

1.2 方 法

1.2.1 玉叶金花果实中粗多糖的提取 玉叶金花干果实磨粉，过0.04 mm筛备用。准确称取10.0 g玉叶金花干果实粉末，用蒸馏水浸提后用2层纱布过滤，离心取上清液，重复浸提2次，合并滤液；减压浓缩至 20 mL，然后加入一定量的95%乙醇进行醇析沉淀，4 ℃静置24 h，4 000 r·min-1离心 10 min 收集沉淀；用20 mL无水乙醇洗沉淀，静置30 min后，离心弃上清液，重复洗2次，4 000 r·min-1 离心 10 min 收集沉淀，烘干称质量，即为粗多糖的含量[8-11]。

1.2.2 玉叶金花果实中粗多糖的精制 取醇析后得到的多糖沉淀物脱脂：用无水乙醇洗沉淀2次，再用无水乙醚洗3次。取20 mL蒸馏水溶解脱脂后的粗多糖，加入20 mL Sevage试剂（氯仿∶正丁醇=4∶1），振荡15 min，3 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液重复多次去游离蛋白，至分离液面交界处无白色混合物，加95%乙醇醇析上清液，4 ℃静置24 h，4 000 r·min-1离心 10 min 收集沉淀，50 ℃烘干至恒质量后，称量精多糖含量[8-11]。

1.2.3 蒽酮-硫酸比色法测定玉叶金花果实中精多糖含量 （1）葡萄糖标准曲线的绘制。准确称取干燥恒质量的无水葡萄糖标准品100.00 mg，加入蒸馏水将其溶解，定容在 100 mL 的容量瓶中，配成 1.00 mg·mL-1的葡糖糖对照品溶液；分别准确移取葡萄糖标准溶液 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，

3.0，3.5 mL，用蒸馏水定容至25 mL，摇匀得系列0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12，0.14 mg·mL-1标准溶液[12]。

（2）蒽酮试剂的配制。准确称取蒽酮0.100 g至小烧杯中，缓慢加入50 mL浓硫酸，边加边搅拌至黄色透明液体，用棕色试剂瓶装好，置冰箱内避光保存，现配现用[13]。

（3）玉叶金花果实中精多糖溶液的配制。准确称取50 ℃烘干至恒质量的玉叶金花果实中精多糖提取物100.00 mg，用蒸馏水溶解定容在100 mL容量瓶中，准确移取2.5 mL至25 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线，用配制好的精多糖溶液测定其吸光度值，再计算出玉叶金花果实中精多糖的含量。

（4）玉叶金花果实中精多糖含量的测定。准确移取葡萄糖标准溶液和玉叶金花果实中精多糖溶液各1 mL至具塞试管中，另准确移取1 mL蒸馏水作为空白对照，沿各试管壁缓慢加入5 mL预冷的蒽酮试剂，盖紧塞子，振荡摇匀，沸水浴中加热10 min，取出，冷水流中冷却20 min，620 nm下测定吸光度值（A）[14]。以吸光度（A）对葡萄糖浓度（C）进行线性回归，得回归方程Y=6.135 7X-0.030 7及 R2值（R2= 0.998 2） （图1）。

按1.2.1方法提取玉叶金花果实中精多糖，配制玉叶金花果实中精多糖溶液。按标准曲线测定方法测定玉叶金花果实中精多糖的含量，并根据以下公式计算玉叶金花果实中精多糖的含量[15]。玉叶金花果实中精多糖含量W= C1/C0×100%。

玉叶金花果实中精多糖吸光度A=0.144，将其代入回归方程Y=6.135 7X-0.030 7，得玉叶金花果实中精多糖浓度C1；配制的玉叶金花果实中精多糖浓度C0=0.1mg·mL-1，代入公式计算，得玉叶金花果实中精多糖含量W=28.5%。

玉叶金花精多糖提取率=X×V/M×100%。式中，X为样液的浓度（g·mL-1），V为样液的体积（mL），M 为玉叶金花质量（g）。

1.2.4 玉叶金花多糖提取工艺的优化

（1）单因素试验。取玉叶金花粉末 10.00 g，按 1.2.1的方法，研究料液比、浸提时间、乙醇醇析的体积、pH值4 个因素对玉叶金花果实中精多糖提取率的影响。

（2）正交試验。以单因素试验为基础，选择料液比、浸提时间、乙醇醇析的体积、pH值 4 个因素，以多糖提取率为指标，采用 L9（34）正交试验进行设计，其因素与水平如表 1所示。

2 结果与分析

2.1 玉叶金花果实中精多糖提取率的单因素试验

2.1.1 料液比对玉叶金花果实中精多糖提取率的影响 取玉叶金花果实粉末 10.00 g，分别按1∶5，

1∶10，1∶15，1∶20，1∶25（g·mL-1）的料液比溶于水，90 ℃恒温水浴 2 h，抽滤，滤液在1.2.1，1.2.2，

1.2.3条件下纯化，并测定玉叶金花果实中精多糖提取率（图2）。

由图 2可知，在一定范围内，随着浸提液体积的增加，玉叶金花果实精多糖提取率逐渐增加；当料液比为 1∶15（g·mL-1）时，玉叶金花果实精多糖提取率最高，再进一步增大浸提液体积至 1∶25（g·mL-1），玉叶金花果实精多糖提取率基本维持恒定。

2.1.2 pH值对玉叶金花果实中精多糖提取率的影响 取玉叶金花果实粉末 10.00 g，按1∶15（g·mL-1）的料液比溶于蒸馏水，调节pH值分别为3，4，5，6，7， 90 ℃恒温水浴 2 h，抽滤。滤液在1.2.1，1.2.2，1.2.3条件下纯化，并测定玉叶金花果实中精多糖提取率（图 3）。

由图3可知，在一定范围内，随着pH值增加，玉叶金花果实中精多糖提取率也增加；当pH值为5时，提取率最高；之后再增加pH值，提取率反而下降。

2.1.3 乙醇醇析的体积对玉叶金花果实中精多糖提取率的影响 取玉叶金花果实粉末 10.00 g，按1∶15（g·mL-1）的料液比溶于蒸馏水，90 ℃恒温水浴2 h，抽滤，将旋转蒸发后的浓缩液，分别按1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5（浓缩液∶乙醇体积）比例醇析，4 ℃醇析24 h，在1.2.1，1.2.2，1.2.3条件下纯化，并测定玉叶金花果实中精多糖提取率（图4）。

由图4可知，在一定范围内，随着乙醇醇析的体积成倍增加，玉叶金花多糖的提取率增加，在1∶3的体积比时提取率达最大，之后乙醇醇析体积再增加对精多糖提取率基本没有大的影响。

2.1.4 浸提时间对玉叶金花果实中精多糖提取率的影响 取玉叶金花果实粉末 10.00 g，按 1∶15（g·mL-1）的料液比溶于蒸馏水，90 ℃恒温水浴分别1，2，3，4，5 h，抽滤，滤液在1.2.1，1.2.2，1.2.3条件下纯化，并测定玉叶金花果实中精多糖提取率，其结果如图 5所示。

由图5可知，浸提时间在1～3 h，玉叶金花果实中精多糖提取率随着浸提时间的延长而增加，在3 h时提取率达到最大；之后浸提时间再增加，提取率基本维持恒定。为了减少能耗，浸提时间控制在3 h。

2.2 玉叶金花果实中精多糖提取的正交试验结果与方差分析

F检验结果表明，pH值对试验结果有显著影响；而其他各因素对综合评价值的影响不显著，故不必再进行各因素水平间的多重比较。此时，可直观地从表2中选择提取率最大的组合 A3B3C2D3为最优组合，即pH值6、浸提时间3 h，料液比1∶15（g·mL-1），乙醇醇析体积倍数1∶4。

2.3 验证正交试验结果

由正交试验优选得最优提取工艺为：料液比1∶15、浸提时间3 h，pH值6、乙醇醇析体积倍数1∶4。由此进行3个平行验证试验，其他步骤同1.2.1，结果如表4所示，在料液比1∶15、浸提时间3 h、pH值6、乙醇醇析体积倍数为1∶4的条件下，玉叶金花果实的精多糖平均提取率为2.71%。

3 结论与讨论

本试验采取醇沉水提法提取玉叶金花果实中精多糖的研究工艺，利用了多糖是强极性分子、具有溶于水而不溶于有机溶剂的特点，同时探讨了pH值、浸提时间、料液比、乙醇醇析体积倍数4个因素对玉叶金花果实精多糖提取率的影响。单因素试验中pH值对玉叶金花果实精多糖提取率的影响是最大的，其次是浸提时间和料液比，乙醇醇析体积倍数是影响最小的因素。正交试验结果也从理论上支持了上述论断。最终优化后的最佳提取工艺参数为料液比1∶15（g·mL-1），浸提时间3 h，pH值6，乙醇醇析体积倍数1∶4，在此条件下，玉叶金花果实中精多糖的提取率为2.71%，多糖含量为28.50%。

新采摘的玉叶金花果实，凝胶黏性大，会导致研磨破碎不完全，使多糖提取率降低，本试验将玉叶金花果实烘干再复水提取则解决了这个问题。除蛋白步骤，本试验采用摇床摇动，使 Sevage 试剂与多糖提取液充分接触，除蛋白效果更好。在调节pH值时应注意一定要边搅拌边缓慢调节，避免出现浸提液酸碱不均匀，防止突然过酸或过碱对试验结果造成影响。浸提时间一定要精确控制，以免出现浸提时间过长或过短对试验结果造成影响。在进行料液比设置时，应先将所需蒸馏水准确量取好再进行浸提，不能直接加入蒸馏水避免水量过多。在进行乙醇醇析时，应尽量保证将所有试验组同时放入4 ℃冰箱中，以减少室温对醇析效果的影响。

具观赏、药用、保健和生态等多种功能的资源植物玉叶金花，育种和栽培容易完成，但目前对玉叶金花的临床研究和制剂开发应用研究仍较缺乏，将来可以考虑对未被利用的组织“果实”加强开发利用。本研究不仅可为玉叶金花多糖提取提供最佳工艺，同时也可为多糖的后续应用研究开发提供理论支撑，提高玉叶金花植株深加工的經济价值和综合开发价值。

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