神经酸对帕金森病模型小鼠运动障碍的缓解作用及机制研究

郑 辉，孙作乾，王志亮，魏正风，冯 炎，张兴柱，王付苍，史永强，高肇林#(.枣庄科技职业学院医学技术系，山东滕州 77500;.山东益康药业股份有限公司山东省晶型药物重点实验室，山东滕州 7753)

神经酸对帕金森病模型小鼠运动障碍的缓解作用及机制研究

郑 辉1，2＊，孙作乾1，王志亮1，魏正风2，冯 炎2，张兴柱2，王付苍2，史永强2，高肇林2#(1.枣庄科技职业学院医学技术系，山东滕州 277500;2.山东益康药业股份有限公司山东省晶型药物重点实验室，山东滕州 277513)

目的:研究神经酸对帕金森病(PD)模型小鼠运动障碍的缓解作用及机制。方法:将小鼠随机分为空白对照组(生理盐水)、模型组(生理盐水)、多巴丝肼片组(阳性对照，按左旋多巴计120mg/kg)和神经酸低、中、高剂量组(20.0、40.0、80.0mg/kg)，每组10只。除空白对照组外，其余各组小鼠均建立PD模型。成模后，每天ig相应药物1次，连续14 d。末次给药后，观察各组小鼠行为学变化，采用高效液相色谱法测定小鼠脑纹状体内多巴胺(DA)及其代谢物二羟苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)的含量。结果:与空白对照组比较，模型组小鼠爬杆时间延长、滚筒时间缩短、自发运动次数减少(P＜0.05)，脑纹状体内DA、DOPAC、HVA含量均降低(P＜0.05)。与模型组比较，多巴丝肼片组和神经酸各剂量组小鼠爬杆时间缩短、滚筒时间延长(P＜0.05)，脑纹状体内DA、DOPAC、HVA含量均升高(P＜0.05);多巴丝肼片组和神经酸高剂量组小鼠自发运动次数增加(P＜0.05)。结论:神经酸可有效改善PD模型小鼠的运动障碍症状，其机制可能与增加脑纹状体内DA含量有关。

神经酸;帕金森病;小鼠;运动障碍;多巴胺

帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)为一种常见的神经系统退行性疾病，临床表现为静止震颤、肌肉强直、自发运动障碍等症状，患者生活自理能力较差。中国现有PD患者约170万人，并保持每年约6%的增长速度[1]。中枢拟胆碱药左旋多巴目前为治疗PD的公认药物，但这种药物长期服用后的不良反应较大，制约了其在临床上的使用。所以，寻找新的药物是目前PD研究领域的热点。

神经酸(Nervonic acid)为一种具有24个碳原子的单不饱和脂肪酸，最先是从哺乳类动物脑神经内分离出来的，室温条件下为白色片状结晶性固体。神经酸作为脑神经细胞中的一种核心神经营养因子，能够修复受损的神经元末梢、促进神经细胞生长发育和提高脑神经活跃程度，是脑细胞生长所必需的营养物质[2]。研究证明，神经酸具有增强免疫功能[3]、防治艾滋病、防治恶性肿瘤、治疗阿尔茨海默病[4]、治疗齐薇格综合征[5]等作用，但未见其在治疗帕金森病方面的应用。本文研究神经酸对模型小鼠PD的缓解作用及机制，为其开发及临床使用提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器

Alliance2695液相色谱仪、2475荧光检测器(美国Waters公司);TGL-20M台式高速冷冻离心机(长沙平凡仪器仪表有限公司)。

1.2 药品与试剂

神经酸(上海恒棵生物科技有限公司，批号:151011，纯度:90.0%);多巴丝肼片(商品名:美多芭，上海罗氏公司，批号:SH2443，规格:每片含左旋多巴200mg、苄丝肼50mg);1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)、多巴胺(DA)、二羟苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)等均购自美国Sigma公司。

1.3 动物

C57BL/6小鼠，SPF级，♀♂各半，8周龄，体质量(20±2)g，由山东大学实验动物中心提供，生产许可证号为SCXK(鲁)2009-0001。

2 方法

2.1 样品的制备

神经酸按每100 g加入30m L聚山梨酯80的比例混合研磨，加纯化水制成白色均匀乳液，用时以纯化水配制成所需浓度即可。

2.2 分组与给药

将小鼠随机分为空白对照组、模型组、多巴丝肼片组(阳性对照，按左旋多巴计120mg/kg)[6]和神经酸低、中、高剂量组(20.0、40.0、80.0mg/kg，给药剂量在参考文献[7]及前期预实验结果的基础上确定)。除空白对照组外，其余各组小鼠ip生理盐水溶解的MPTP溶液25 mg/kg，每天1次，连续5 d。选取步长变短、活动减少、运动缓慢、全身震颤、竖毛竖尾等行为改变的小鼠作为合格PD模型小鼠，每组10只，♀♂各半。5 d后，各给药组小鼠ig相应药物0.2m L/10 g，空白对照组和模型组小鼠ig等体积生理盐水，每天1次，连续14 d。末次给药24 h后，进行行为学实验。

2.3 行为学实验

2.3.1 爬杆实验 将一个圆形小球(直径3 cm)固定于一根竹杆(长50 cm，直径1 cm)的顶部，竹杆表面缠绕多层纱布以免打滑。夹住小鼠尾尖，鼠头朝下放在杆顶，并保证其双后肢落在小球表面，然后使其顺着竹杆顺势爬下。自小鼠适应环境4 d后开始计时，从附在杆顶头朝下开始，到双前肢接触小杆底端结束，记录小鼠爬杆时间。

2.3.2 滚筒实验 将小鼠放在滚筒仪的表面上，调整仪器旋转速度为35 r/m in。自小鼠适应环境4 d后开始计时，小鼠站在筒上滚筒旋转开始，到从滚筒上掉落结束，记录小鼠在滚筒上的持续时间。

2.3.3 自发运动实验 参考文献[8]进行实验。把小鼠放在自发运动仪中心，确保环境安宁不嘈杂。打开自发运动监测仪，使红外线自由穿过，当小鼠活动时可阻挡红外线，自小鼠适应环境2m in后开始计时，记录5min内小鼠运动次数。

2.4 脑纹状体内DA及其代谢产物DOPAC、HVA含量的测定

[9]测定各组小鼠脑纹状体内DA及其代谢产物DOPAC、HVA含量。

2.4.1 色谱条件色谱柱:ZORBAX SB C18(250mm× 4.6 mm，5μm);流动相:(0.02 mol/L枸橼酸钠-0.05 mol/L磷酸氢二钠)-甲醇(95∶5);流速:1.0m L/min;柱温:35℃;发射波长:285 nm，激发波长:333 nm;进样量: 20μL。

2.4.2 线性关系 分别精密称取DA、DOPAC、HVA适量，用流动相稀释制成300、50、50μg/m L的贮备液。精密量取各贮备液适量，按需要用流动相稀释成系列质量浓度，按“2.4.1”项下方法进样测定，记录峰面积。以药物质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)进行回归分析。

2.4.3 准确度、基质效应、精密度 按相关方法操作考察本方法的准确度、基质效应和精密度。

2.4.4 测定方法 行为学实验完成后，小鼠剪头取脑放在冰盘表面并迅速剥离出纹状体，称质量后置于2m L EP管内，准确加入0.1mol/L冰冷高氯酸溶液1.0m L，在冰浴条件下超声(5 kHz，30 s)使细胞壁破损，4℃下10 000 r/min(离心半径为10 cm)离心30min，取上清液进样测定。

2.5 统计学方法

采用SPSS 18.0软件进行统计分析。数据用±s表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 行为学考察结果

与空白对照组比较，模型组小鼠的爬杆时间明显延长，滚筒持续时间明显缩短，自发运动次数明显减少(P＜0.05)。与模型组比较，各给药组小鼠的爬杆时间均明显缩短，滚筒持续时间均明显延长(P＜0.05);多巴丝肼片组和神经酸高剂量组小鼠的自发运动次数明显增加(P＜0.05)。各组小鼠行为学考察相关指标测定结果见表1。

3.2 含量测定结果

本文色谱条件下，其他辅料均不干扰DA、DOPAC和HVA的测定，其日内精密度试验的含量RSD分别为5.4%～11.4%、4.9%～12.6%、5.1%～11.9(n=5)，日间精密度试验的含量RSD分别为7.1%～10.1%、10.8%～12.4%、11.8%～13.1(n=3);准确度分别为99.6%～106.6%、99.8%～111.0%、99.4%～108.0%(n=3);基质效应分别为86.9%～105.3%、91.7%～102.8%、94.5%～102.1%。DA、DOPAC和HVA的线性关系见表2。

表1 各组小鼠行为学考察相关指标测定结果(±s，n=10)Tab 1 Determ ination results of related indexes in behavioral study ofm ice in each group(±s，n= 10)

表1 各组小鼠行为学考察相关指标测定结果(±s，n=10)Tab 1 Determ ination results of related indexes in behavioral study ofm ice in each group(±s，n= 10)

注:与空白对照组比较，＊P＜0.05;与模型组比较，#P＜0.05Note:vs.blank controlgroup，＊P＜0.05;vs.modelgroup，#P＜0.05

组别空白对照组模型组多巴丝肼片组神经酸低剂量组神经酸中剂量组神经酸高剂量组滚筒持续时间，s 601±21.55 256±14.89＊421±18.66#314±16.08#367±15.99#388±17.05#爬杆时间，s 6.21±1.52 36.66±5.08＊8.62±1.14#11.59±1.23#10.01±1.11#9.83±1.03#自发运动次数96.5±17.9 70.8±16.8＊92.8±17.2#79.7±16.7 84.6±17.6 89.8±17.4#

表2 DA、DOPAC和HVA的线性关系Tab 2 Linear relationshipsof DA，DOPAC and HVA

3.3 脑纹状体内DA、DOPAC和HVA含量测定结果

与空白对照组比较，模型组小鼠脑纹状体内DA、DOPAC、HVA含量明显减少(P＜0.05)。与模型组比较，各给药组小鼠脑纹状体内DA、DOPAC、HVA含量明显增加(P＜0.05)。各组小鼠脑纹状体内DA、DOPAC、HVA含量的测定结果见表3。

表3 各组小鼠脑纹状体内DA、DOPAC、HVA含量的测定结果(±s，n=10，ng/m g)Tab 3 Determ ination results of DA，DOPAC，HVA concentrations in the striatum ofm ice in each grou(p±s，n=10，ng/mg)

表3 各组小鼠脑纹状体内DA、DOPAC、HVA含量的测定结果(±s，n=10，ng/m g)Tab 3 Determ ination results of DA，DOPAC，HVA concentrations in the striatum ofm ice in each grou(p±s，n=10，ng/mg)

注:与空白对照组比较，＊P＜0.05;与模型组比较，#P＜0.05Note:vs.blank controlgroup，＊P＜0.05;vs.modelgroup，#P＜0.05

组别空白对照组模型组多巴丝肼片组神经酸低剂量组神经酸中剂量组神经酸高剂量组HVA 0.83±0.10 0.16±0.03＊0.71±0.09#0.37±0.06#0.46±0.08#0.60±0.07#DA 5.66±0.83 0.48±0.03＊4.18±0.94#1.09±0.27#1.75±0.43#2.41±0.38#DOPAC 0.99±0.17 0.17±0.06＊0.89±0.15#0.50±0.14#0.62±0.24#0.76±0.06#

4 讨论

PD的发病机制相对复杂，目前认为其病理变化部位为中脑部黑质-纹状体DA能神经元。由于DA是抑制运动行为的关键性神经递质，而乙酰胆碱(Ach)则是兴奋运动行为的关键性神经递质，故黑质-纹状体DA能神经元发生退行性改变，导致DA浓度显著下降，致使胆碱能神经功能相对亢进，从而出现PD症状。当DA含量降低至50%以下时，会导致纹状体内DA和Ach平衡严重失调，产生静止震颤、肌肉强直、自发运动障碍等PD症状。目前，临床上常用药物进行治疗，作用机制为使纹状体内DA和Ach重新达到平衡，从而缓解PD症状[10]。

MPTP作为一种常用的造模用特殊神经毒物，其脂溶性高，易经血液循环穿过血脑屏障进入脑内，能损伤DA能神经元。本实验采用MPTP诱发小鼠PD模型，结果显示，PD模型小鼠自发活动较少，啃食东西及整理皮毛动作明显减少，攀爬行为减少，有的小鼠甚至出现啃食艰难、体质量降低、姿势协调功能较差等。此外，模型小鼠脑纹状体中DA、DOPAC和HVA含量较正常小鼠明显降低，这些现象与现有PD模型报道[11-13]一致。因此，本实验建立的小鼠PD模型科学可靠。

本研究结果显示，PD模型小鼠ig神经酸后，其爬杆时间缩短，滚筒持续时间延长，自发活动次数增加，说明神经酸能提高PD模型小鼠的活动平衡及运动协调能力，可有效改善PD模型小鼠运动迟缓和肌肉强直等运动功能障碍症状。DOPAC和HVA为DA代谢产物，脑内DOPAC和HVA的含量能间接反映DA含量的高低。本研究结果显示，模型组小鼠脑纹状体中DA、DOPAC和HVA含量较空白对照组明显降低，而神经酸各剂量组和多巴丝肼片组小鼠脑纹状体中DA、DOPAC和HVA含量较模型组明显增加，说明神经酸缓解PD模型小鼠运动功能障碍症状的机制可能与增加脑纹状体内DA含量有关。

参考文献

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(编辑:邹丽娟)

Study on the A lleviation Effect and Its M echanism of Nervonic Acid on M ovement Disorder of M odel M ice w ith Parkinson’s Disease

ZHENG Hui1，2，SUN Zuoqian1，WANG Zhiliang1，WEI Zhengfeng2，FENG Yan2，ZHANG Xingzhu2，WANG Fucang2，SHIYongqiang2，GAO Zhaolin2(1.Dept.of Medical Technology，Zaozhuang Vocational College of Science &Technology，Shandong Tengzhou 277500，China;2.Shandong Province Key Laboratory of Polymorph Drugs，Shandong Yikang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Shandong Tengzhou 277513，China)

OBJECTIVE:To study the alleviation effect of nervonic acid on movement disorder ofmodelmice w ith Parkinson’s disease(PD).METHODS:M ice were random ly divided into blank control group(normal suline)，model group(normal saline)，Levodopa and benserazide hydrochloride tablet group(positive control，calculated by L-dopam ine 120 mg/kg)，nervonic acid low-dose，medium-dose，high-dose groups(20.0，40.0，80.0 mg/kg)，10 in each group.Except for blank control group，m ice in other groups were inducced for PD models.After modeling，m ice were intragastrically given relevantmedicines，once a day，for 14 d.After the last administration，behavioral changes ofm ice in each group were observed.HPLC was conducted to detect dopam ine(DA)and itsmetabolites dihydroxybenzoic acid(DOPAC)，homovanillic acid(HVA)concentrations in the striatum ofm ice. RESULTS:Compared w ith blank control group，climbing time was extended in model group，drum time was shortened，spontaneous movement times was decreased，and DA，DOPAC，HVA contents in the striatum were reduced(P＜0.05).Compared w ith model group，climbing time was shortened in Levodopa and benserazide hydrochlo ride tablet group，nervonic acid dose groups，drum time was extended，and DA，DOPAC，HVA contents in the striatum were increased(P＜0.05);and spontaneousmovement times was increased in Levodopa and benserazide hydrochloride tablet group，and nervonic acid high-dose group(P＜0.05).CONCLUSIONS:Nervonic acid can effectively improve symptoms of movement dysfunction of modelmice w ith PD.The mechanism may associate w ith increasing DA content in the striatum.

Nervonic acid;Parkinson’s disease;M ice;Movement disorder;Dopam ine

R965

A

1001-0408(2017)19-2648-04

2016-10-24

2016-12-09)

＊讲师，硕士。研究方向:新药开发。电话:0632-5953070。E-mail:zhenghui198334@163.com

#通信作者:高级工程师，博士。研究方向:新药开发。电话: 0632-5953070。E-mail:sdykyy@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.16