鸡冠花正丁醇萃取物改善大鼠功能失调性子宫出血的机制研究Δ

顾媛媛，赵润琴，石 朗，张允菲，冯 程，方 芳，张淑香，王连芝，陈大忠(.黑龙江中医药大学中医药研究院，哈尔滨 50040;.黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室，哈尔滨 50040)

鸡冠花正丁醇萃取物改善大鼠功能失调性子宫出血的机制研究Δ

顾媛媛1＊，赵润琴2#，石 朗2，张允菲1，冯 程1，方 芳1，张淑香1，王连芝1，陈大忠1(1.黑龙江中医药大学中医药研究院，哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室，哈尔滨 150040)

目的:研究鸡冠花正丁醇萃取物对大鼠功能失调性子宫出血的改善作用，并探讨其作用机制。方法:将60只受孕SD大鼠随机分为空白组、模型组、宫血宁胶囊组(阳性对照，0.07 g/kg)和鸡冠花正丁醇萃取物高、中、低剂量组(4.32、2.16、1.08 g/kg)，每组10只。除空白组外，其余各组大鼠均在妊娠第7天ig米非司酮溶液和米索前列醇溶液造成不完全流产，以复制功能失调性子宫出血模型。从妊娠第8天开始，给药组大鼠ig相应药物，空白组和模型组大鼠ig等体积生理盐水，每天早、晚各给药1次，连续7 d。给药结束后，测定大鼠子宫出血量以及血清中血栓素(TXA2)、前列环素(PGI2)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量。结果:与空白组比较，模型组大鼠子宫出血量显著增加(P＜0.01)，血清中TXA2含量显著减少、PGI2和TNF-α含量显著增加(P＜0.01)。与模型组比较，各给药组大鼠的子宫出血量均显著减少、血清中TXA2含量均显著增加(P＜0.01);宫血宁胶囊组和鸡冠花正丁醇萃取物高剂量组大鼠血清中PGI2、TNF-α含量，以及鸡冠花正丁醇萃取物中剂量组大鼠血清中TNF-α含量均显著减少(P＜0.01)。结论:鸡冠花正丁醇萃取物对药物流产不全致大鼠功能失调性子宫出血有明显的改善作用，其作用机制可能与调节TXA2/PGI2动态平衡、抑制TNF-α的过度分泌有关。

鸡冠花;正丁醇萃取物;功能失调性子宫出血;止血;大鼠

鸡冠花始载于《嘉佑本草》，为苋科青葙属植物鸡冠花(Celosia cristata L.)的干燥花序，其味甘、涩，性凉，归肝、大肠经，功效为收敛止血、止带、止痢[1]。据《本草纲目》记载:“鸡冠花可治疗痔漏下血，齿白下痢，崩中等”，适用于功能失调性子宫出血、产后出血、吐血、崩漏、血淋、便血等病症[2]，为妇科常用之良药。有研究资料表明，鸡冠花具有较好的凉血、止血作用，对功能失调性子宫出血具有较好的疗效[3]。本课题组前期研究也发现，鸡冠花具有较好的止血、凝血作用，且确定鸡冠花正丁醇萃取物为有效部位，故本研究建立大鼠子宫出血模型，研究鸡冠花正丁醇萃取物对大鼠功能失调性子宫出血的止血作用及作用机制，为其临床应用提供参考。

1 材料

1.1 仪器

UV-1800紫外分光光度仪(日本岛津公司);JA2003精密电子天平(上海良平仪器厂);Thermo MK3酶标仪(美国塞默飞世尔科技有限公司);Nikon Eclipse TE2000-E倒置显微镜[尼康(上海)仪器有限公司];TDL-60B低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 药材、药品与试剂

鸡冠花采摘于黑龙江中医药大学药用植物园，经黑龙江中医药大学王振月教授鉴定为苋科青葙属植物鸡冠花(Celosia cristata L.)的干燥花序;宫血宁胶囊(云南白药集团股份有限公司，批号:ZGA1605，规格:0.13 g/粒);米非司酮片(批号:43160303，规格:25mg/片)、米索前列醇片(批号:43160303，规格:0.2mg/片)均购自华润紫竹药业有限公司;血栓素(TXA2，批号:201609)、前列环素(PGI2，批号:201609)、肿瘤坏死因子α(TNF-α，批号:201609)酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒均由天津子涵生物科技有限公司提供;其余试剂均为化学纯。

1.3 动物

SPF级健康SD大鼠120只[♀:90只，体质量(250± 10)g;♂:30只，体质量(280±20)g]，由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供，合格证号:SCXK(黑) 2013-004。

2 方法

2.1 鸡冠花正丁醇萃取物的制备

将鸡冠花干燥花序粗粉加8倍量的95%乙醇回流提取3次，每次2 h，提取液减压浓缩，用水混悬后，再分别用等体积的二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取3次，取正丁醇萃取液减压回收溶剂，得到正丁醇萃取物干浸膏(每1 g干浸膏相当于原药材30.50 g)，备用。

2.2 造模、分组与给药

将大鼠按♀∶♂为2∶1～3∶1的比例合笼，次日进行阴道涂片检查，若发现精子或阴栓表示受孕成功，作为妊娠第1天;若未受孕，待下次继续合笼受孕。取受孕成功的♀鼠60只，采用随机数字表法分为6组，每组10只，分别为空白组、模型组、宫血宁胶囊组和鸡冠花正丁醇萃取物高、中、低剂量组。除空白组外，其余各组大鼠分别于妊娠第7天ig米非司酮溶液(上午8:00，8.3mg/kg)和米索前列醇溶液(下午18:00，0.1mg/kg)，造成早孕大鼠不完全流产的功能失调性子宫出血模型[4-5];同时于♀鼠阴道内置入消毒棉球，吸收子宫出血物，次日分别于早、晚将棉球取出，放入封口袋中，于4℃冰箱冷藏保存，每天更换2次新棉球，直至妊娠第14天。从妊娠第8天开始，宫血宁胶囊组大鼠ig宫血宁胶囊0.07 g/kg(蒸馏水溶解，按临床的等效剂量换算而得);鸡冠花正丁醇萃取物高、中、低剂量组大鼠分别ig鸡冠花正丁醇萃取物4.32、2.16、1.08 g/kg(分别按临床剂量的4、2、1倍换算而得);空白组和模型组大鼠ig等体积(5m L)的蒸馏水，每天早、晚各给药1次，连续7 d。

2.3 大鼠子宫出血量的测定

末次给药后1 h将大鼠麻醉，下腔静脉取血20μL，加入5%NaOH溶液4m L[6]，用移液枪混匀，以5%NaOH溶液调零，采用紫外分光光度仪于546 nm波长处测定静脉血吸光度(A)值。将每只大鼠子宫出血棉球收集后置于烧杯内，根据出血量的情况酌情加入5%NaOH溶液[7]，浸渍提取24 h后，测定浸渍液的A值，计算子宫出血量:子宫出血量(m L)=静脉血量×(子宫浸提液A值× V2)/(静脉血A值×V1)，其中V1为稀释静脉血所用的NaOH溶液的体积(4m L)，V2为浸提子宫血所用NaOH溶液的体积。

2.4 大鼠血清中TXA2、PGI2和TNF-α含量的测定

乌拉坦麻醉大鼠后下腔静脉取血2m L，以离心半径为10 cm、3 500 r/min离心20min，取上清，按照试剂盒说明书，采用ELISA法测定血清中TXA2、PGI2和TNF-α的含量。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 鸡冠花正丁醇萃取物对大鼠子宫出血量的影响

与空白组比较，模型组大鼠子宫出血量显著增加(P＜0.01);与模型组比较，宫血宁组和鸡冠花正丁醇萃取物各剂量组大鼠子宫出血量均显著减少(P＜0.01)，结果详见表1。

表1 各组大鼠子宫出血量测定结果(±s，n=10)Tab 1 Determ ination results of uterine bleeding amountof rats in each grou(p±s，n=10)

表1 各组大鼠子宫出血量测定结果(±s，n=10)Tab 1 Determ ination results of uterine bleeding amountof rats in each grou(p±s，n=10)

注:与空白组比较，＊＊P＜0.01;与模型组比较，##P＜0.01Note:vs.blank group，＊＊P＜0.01;vs.modelgroup，##P＜0.01

组别空白组模型组宫血宁胶囊组鸡冠花正丁醇萃取物高剂量组鸡冠花正丁醇萃取物中剂量组鸡冠花正丁醇萃取物低剂量组子宫出血量，mL 0.0724±0.0111 0.7807±0.0998＊＊0.4881±0.0716##0.1872±0.0193##0.4856±0.1347##0.5326±0.1167##剂量，g/kg 0.07 4.32 2.16 1.08

3.2 鸡冠花正丁醇萃取物对大鼠血清中TXA2、PGI2和TNF-α含量的影响

与空白组比较，模型组大鼠血清中TXA2含量显著减少(P＜0.01)，PGI2、TNF-α含量显著增加(P＜0.01);与模型组比较，各给药组大鼠血清中TXA2含量均显著增加(P＜0.01)，宫血宁胶囊组和鸡冠花正丁醇萃取物高剂量组大鼠血清中PGI2含量均显著减少(P＜0.01)，宫血宁组和鸡冠花正丁醇萃取物高、中剂量组大鼠血清中TNF-α含量均显著减少(P＜0.01)，结果详见表2。

表2 各组大鼠血清中TXA2、PGI2、TNF-α含量测定结果(±s，n=10，ng/L)Tab 2 Determ ination resultsof TXA2，PGI2and TNF-α contents in serum of rats in each group(±s，n=10，ng/L)

表2 各组大鼠血清中TXA2、PGI2、TNF-α含量测定结果(±s，n=10，ng/L)Tab 2 Determ ination resultsof TXA2，PGI2and TNF-α contents in serum of rats in each group(±s，n=10，ng/L)

注:与空白组比较，＊＊P＜0.01;与模型组比较，##P＜0.01Note:vs.blank group，＊＊P＜0.01;vs.modelgroup，##P＜0.01

组别空白组模型组宫血宁胶囊组鸡冠花正丁醇萃取物高剂量组鸡冠花正丁醇萃取物中剂量组鸡冠花正丁醇萃取物低剂量组TNF-α 94.86±9.88 185.56±17.52＊＊96.99±9.07##114.74±11.47##144.61±13.52##158.27±15.97剂量，g/kg 0.07 4.32 2.16 1.08 TXA2161.81±29.01 89.82±12.43＊＊139.45±25.35##145.61±22.39##123.70±21.32##108.31±18.44##PGI245.03±13.71 81.45±11.24＊＊63.03±14.22##61.44±7.30##75.78±12.70 79.88±11.84

4 讨论

功能失调性子宫出血为妇科急症之一，在中医学中属于“崩漏”范畴[8]，多由于脾虚不能统血、冲任失固所致，若时日持久，则耗伤气血，使病情加重难以治愈。本研究采用ig米非司酮溶液和米索前列醇溶液的方法建立早孕大鼠子宫出血模型，可用于功能失调性子宫出血治疗药物的筛选和评价。宫血宁胶囊对子宫出血具有较好的治疗作用，且对子宫内膜有明显的修复作用，临床应用广泛，再结合文献[9]报道确定其为本研究的阳性药物。

在前列腺素类物质中，TXA2是目前发现的最强的血管收缩剂，其由血小板产生，具有强烈的血小板聚集及血管收缩作用;同时其可使血小板膜上的腺苷环化酶受到抑制，减少环腺苷酸的生成，促使血小板活化，从而促进血栓形成。PGI2则是作用较强的血管舒张剂，主要在血管内皮细胞中产生，能够较强地抑制血小板聚集，又能够使已聚集的血小板溶散，是目前已知的抑制血小板聚集最强的物质。TXA2/PGI2是体内的一对动态平衡因子，对维持血小板内环境的稳定、控制正常的止血机制及防止血栓形成具有重要意义，若此比例失衡，可导致子宫内膜出血或异常出血[10-11]。本研究结果显示，高剂量鸡冠花正丁醇萃取物能显著升高造模大鼠血清中TXA2含量，降低血清中PGI2含量。TNF-α是炎症反应过程中重要的促炎因子，可激活多种炎性信号通路，与多种免疫炎症性疾病有关。本研究结果显示，高、中剂量鸡冠花正丁醇萃取物均能显著降低造模大鼠血清中TNF-α含量。

综上所述，鸡冠花正丁醇萃取物对大鼠功能失调性子宫出血具有明显改善作用，其机制可能与调节TXA2/ PGI2动态平衡和抑制TNF-α的过度分泌有关。

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Study on the M echanism of Celosia cristata N-butanol Extracts in the Im provement of Dysfunctional Uterine Bleeding of Rats

GU Yuanyuan1，ZHAO Runqin2，SHI Lang2，ZHANG Yunfei1，FENG Cheng1，FANG Fang1，ZHANG Shuxiang1，WANG Lianzhi1，CHEN Dazhong1(1.Research Institute of TCM，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China;2.Preparation Room，the First A ffiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China)

OBJECTIVE:To study the improvement effect of Celosia cristata n-butanol extracts on dysfunctional uterine bleeding of rats，and explore itsmechanism.METHODS:60 pregnant SD rats were random ly divided into blank group，model group，Gongxuening capsule group(positive control，0.07 g/kg)and C.cristata n-butanol extracts high-dose，medium-dose，low-dose groups(4.32，2.16，1.08 g/kg)，10 in each group.Except for the blank group，rats in other groups were intragastrically given m ifepristone and m isoprostol on 7th of pregnancy for resulting incomplete abortion to inducemodels of dysfunctional uterine bleeding. Then rats in administration groups were intragastrically given relevantmedicines，rats in blank group and model group were intragastrically given normal saline once every morning and evening，for 7 d.On 8th d of pregnancy，uterine bleeding amount，and thromboxane(TXA2)，prostacyclin(PGI2)and tumor necrosis factorα(TNF-α)contents in serum were determ ined.RESULTS: Compared w ith blank group，uterine bleeding amount in model group was significantly increased(P＜0.01)，TXA2content in serum was significantly reduced，PGI2and TNF-αcontentswere significantly increased(P＜0.01).Compared w ithmodel group，uterine bleeding amounts in adm inistration groups were significantly reduced，TXA2content in serum was significantly increased(P＜0.01);PGI2and TNF-αcontents in serum in Gongxuening capsule group and C.cristata n-butanol extracts high-dose group and TNF-αcontent in serum in C.cristata n-butanol extracts medium-dose group were significantly reduced(P＜0.01).CONCLUSIONS:C.cristata n-butanol extracts show obvious improvement effect on incomplete drug abortion-induced dysfunctional uterine bleeding of rats，and themechanism may be related to the regulation of TXA2/PGI2dynamic balance and inhibition of TNF-αtransient secretion.

Celosia cristata;N-butanol extracts;Dysfunctional uterine bleeding;Hemostasis;Rats

R711;R285

A

1001-0408(2017)19-2617-03

2017-01-07

2017-03-21)

(编辑:林 静)

黑龙江省中医药科研项目(No.ZHY16-101);黑龙江省自然科学基金面上项目(No.H201468)

＊助理研究员，博士。研究方向:中药药效物质基础及分子机制。电话:0451-87267072。E-mail:yuanwas@163.com

#通信作者:副主任药师，硕士。研究方向:中药药效物质基础。E-mail:1577268711@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.07