基于一测多评法测定甘肃红芪中4种黄酮类成分

杨秀娟 邵晶 杨志军 吴国霞 宁艳梅 张金保 黑生瑞

摘要：目的 建立甘肃红芪中芒柄花苷、毛蕊异黄酮、金雀异黄酮、芒柄花素4种黄酮类成分的一测多评法，验证该方法在红芪质量评价中应用的准确性及可行性。方法 以毛蕊异黄酮为内标，分别建立毛蕊异黄酮与芒柄花苷、金雀异黄酮、芒柄花素的相对校正因子，计算红芪中毛蕊异黄酮、金雀异黄酮、芒柄花素的含量，实现一测多评。结果 各相对校正因子重复性良好，一测多评法测定结果与外标法无显著差异。结论 以毛蕊异黄酮为内标，同时测定芒柄花苷、金雀异黄酮、芒柄花素的一测多评法可用于红芪的定量分析。

关键词：一测多评；红芪；芒柄花苷；毛蕊异黄酮；金雀异黄酮；芒柄花素；相对校正因子

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.015

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）08-0066-04

Content Determination of Four Flavonoids in Hedysari Radix in Gansu Province Based on Quantitative Analysis of Multi-components by Single Marker YANG Xiu-juan1，2， SHAO Jing1，2， YANG Zhi-jun1，2， WU Guo-xia1， NING Yan-mei1，2， ZHANG Jin-bao1，2， HEI Sheng-rui1 （1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese and Tibetan Medicine of Gansu Province， Lanzhou 730000， China）

Abstract： Objective To establish a method for simultaneous determination for the contents of four flavones （ononin， calycosin， genistein and formononetin） of Hedysari Radix in Gansu Province with quantitative analysis of multi-components by single-marker （QAMS）； To prove its feasibility and accuracy. Methods Calycosin was taken as internal standard substance. Relative correction factors （RCF） of ononin， genistein and formononetin to calycosin were established. The contents of ononin， calycosin， genistein and formononetin were determined to realize QAMS. Results RCF was with good repeatability. The results of QAMS were consistent with the results of the external standard method. Conclusion The method that determines the contents of ononin， genistein and formononetin with calycosin as internal standard substance， can be used for quantitative analysis of Hedysari Radix.

Key words： quantitative analysis of multi-components by single marker； Hedysari Radix； ononin； calycosin； genistein； formononetin； relative correction factor

紅芪是豆科植物多序岩黄芪Hedysarum polybotrys Hand. Mazz.的干燥根[1]，其性微温、味甘，归肺、脾经，具有补气升阳、利水消肿、生津养血等功效。红芪根皮为红棕色，因此而得名，最早记载于《神农本草经》，南北朝时期梁代陶弘景在《本草经

基金项目：甘肃省财政厅高等学校基本科研业务费项目（BH-2013-20）；甘肃省高等学校基本科研基金资助项目（BH2012-020）；甘肃省高等学校科研项目（2016B-054）；甘肃中医药大学中青年科研基金项目（2305016601）

通讯作者：杨志军，E-mail：yangzhijun1971@yeah.net

集注》中描述：“有赤色者，可作膏贴，俗方多用，道家不须。”红芪现主要分布在甘肃陇南、天水、定西等地区，一般被认为是甘肃的道地药材，为十大陇药之一[2]。目前，较多学者就红芪化学成分及其药理活性展开了大量研究，发现红芪中含有较多的活性物质如黄酮[3]、皂苷[4]、生物碱、氨基酸、有机酸、甾醇、多糖[5]、微量元素[6]等，且药理作用广泛，主要包括提高免疫能力、强心利尿、抗自由基、抗病毒等[7]。

一测多评法是利用中药有效成分之间的内在函数和比例关系测定1个成分而实现多个成分的同步测定，该方法已在枳实、大黄、淫羊藿等药材的含量测定中得到应用[8-11]，2015年版《中华人民共和国药典》收载了黄连等药材的一测多评法含量测定。本研究采用一测多评法测定红芪中4种黄酮类成分，为红芪药材多指标定量测定提供全新的分析模式。

1 仪器与试药

Agilent1260高效液相色谱仪（DAD检测器，四元泵），Hanbon Sci. &Tech.Phecda; C18色谱柱（5 ?m，4.6 mm×250 mm），电子天平（AL104，梅特勒-托利多仪器上海有限公司），恒温水浴锅（HH-S，金坛市大地自动化仪器厂），超声清洗仪（KQ-250，昆山市超声仪器有限公司），电热恒温鼓风干燥箱（SFG-02B，黄石市恒丰医疗器械有限公司）。

芒柄花苷、毛蕊异黄酮、金雀异黄酮、芒柄花素对照品（批号分别为PY150816RM、PY150826RM、PY150814RC、PY150822YG，南京普怡生物科技有限公司，纯度均为99%），乙腈为色谱纯，甲醇、磷酸等其他试剂均为分析纯。

11批红芪样品分别采自甘肃武都、陇西、甘谷、武山等10个产地，经甘肃中医药大学药学院李成义教授鉴定为豆科植物多序岩黄芪Hedysarum polybotrys Hand. Mazz.的干燥根，样品来源见表1。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备

精密称取芒柄花苷、毛蕊异黄酮、金雀异黄酮、芒柄花素对照品适量，加甲醇分别制成0.481 3、0.492 0、0.130 5、0.452 6 mg/mL的对照品溶液。取上述溶液适量于同一量瓶中，制得混合溶液，即浓度分别为0.048 13、0.049 20、0.003 95、0.045 26 mg/mL的对照品贮备液A。精密量取对照品贮备液A 1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液B。

2.2 供试品溶液制备

取红芪样品粉末（过2号筛）约3 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件

色谱柱：Hanbon Sci. &Tech.Phecda; C18（5 ?m，4.6 mm×250 mm）；流动相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～10 min，10%～15%B；10～15 min，15%～25%B；15～35 min，25%～45%B；35～45 min，45%～60%B）；柱温：25 ℃；波长：254 nm；进样量：10 ?L；流速：1 mL/min。记录45 min色谱图，供试品和对照品分离情况良好，见图1。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 取上述对照品贮备液A、B，分别进样2.5、5、10、15、20 ?L，分析记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标，对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线，得到各对照品的回归方程和线性范围（见表2）。结果表明，芒柄花苷、毛蕊异黄酮、金雀异黄酮、芒柄花素4种成分在各自的范围内呈良好线性关系。

2.4.2 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液，连续进样6次，计算芒柄花苷、毛蕊异黄酮、金雀异黄酮、芒柄花素的峰面积RSD分别为2.14%、1.46%、2.34%、1.70%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性试验 精密称取同一红芪样品（GS-2）粉末6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件分别进样测定。结果芒柄花苷、毛蕊异黄酮、金雀异黄酮、芒柄花素的含量分别为0.108 9、0.025 5、0.003 6、0.117 0 mg/g，各成分含量RSD分别为3.77%、0.82%、2.56%、0.96%，表明本方法重复性较好。

2.4.4 穩定性试验 精密吸取同一红芪（GS-2）供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h按“2.3”项下色谱条件进样10 ?L，测得芒柄花苷、毛蕊异黄酮、金雀异黄酮、芒柄花素的峰面积RSD分别为3.44%、0.93%、2.17%、1.34%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取已测定的样品6份，每份1.5 g，分别加入一定量对照品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件分别进样测定，结果芒柄花苷、毛蕊异黄酮、金雀异黄酮、芒柄花素的平均加样回收率分别为98.81%、102.54%、101.87%、98.28%，RSD分别为2.08%、1.84%、2.38%、2.32%，表明本方法准确度良好。

2.5 相对校正因子的测定

2.5.1 待测成分相对校正因子的计算 取混合对照品溶液，按“2.3”项下条件进行测定，分别进样1、2.5、5、10、15 ?L，以毛蕊异黄酮为内标，分别计算芒柄花苷、金雀异黄酮、芒柄花素的相对校正因子（fR）。计算公式：fR=fs/i=（As×Ci）/（Ai×Cs），式中As为内标峰面积，Cs为内标浓度，Ai为待测成分对照品峰面积，Ci为待测成分对照品浓度。结果见表3。

2.5.2 相对校正因子重现性考察 分别采用Hanbon Sci. &Tech.Phecda; C18和Angilent XDB色谱柱，分别考察了Angilent 1260和Angilent 1200液相色谱系统对校正因子的影响，结果各成分相对校正因子的重现性良好（RSD<5%），见表4。

2.5.3 相对校正因子的确定 根据《一测多评法建立的技术指南》[12]，综合影响校正因子的因素，取各次试验结果平均值，最终确定芒柄花苷、金雀异黄酮、芒柄花素的相对校正因子分别为1.15、0.72、0.75。

2.5.4 待测成分色谱峰的定位 计算在不同色谱仪器或不同色谱柱中各待测成分色谱峰与毛蕊异黄酮色谱峰的相对保留时间（rk/s）。rk/s=TR（k）/TR（s），式中k为待测组分，s为对照物。利用相对保留时间定性，对各待测成分进行定位。结果表明相对保留时间的波动较小，其RSD均小于5%，见表5。

2.6 一测多评法与外标法测定结果的比较

分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10 ?L，注入高效液相色谱仪，依法测定11批样品，采用外标法和一测多评法计算红芪中芒柄花苷、毛蕊异黄酮、金雀异黄酮、芒柄花素含量，结果见表6。并对一测多评法与外标法得到的量值进行比较，2种方法所得值的偏差均在5%以内，由此说明一测多评法用于红芪药材及其炮制品的多成分质量评价研究是可行的。

3 讨论

毛蕊异黄酮对照品在市场上可购得，且试验发现，以毛蕊异黄酮为内标，在不同色谱柱和不同色谱仪上保留时间差值波动最小，均在5%以内。而若以芒柄花苷为内标，则保留时间差值的波动均大于5%，不宜进行待测组分色谱峰的定位。故最终确定以毛蕊异黄酮为内标，建立红芪中4种黄酮类成分的一测多评方法。

在色谱条件的考察过程中，我们对检测波长、流动相组成、样品提取方式、提取溶剂及提取时间均做了考察。经HPLC-DAD检测器全波长扫描，综合考虑，优选出芒柄花苷、毛蕊异黄酮、金雀异黄酮、芒柄花素的检测波长为254 nm；通过考察甲醇及乙醇2种溶媒及提取时间30 min、1 h、2 h，优化出最佳提取条件为红芪用甲醇回流提取1 h。

红芪主产于甘肃武都、宕昌、甘谷、武山、陇西等地。本试验采集了甘肃10个产地11批红芪药材，用校正因子法从一测多评的角度阐明了主要成分间的相互关系，实现在对照品短缺的情况下进行多指标成分含量测定。结果表明，一测多评法与外标法实测值间没有显著差异，说明建立的校正因子具有较好的可信度。采用一测多评法对红芪进行更全面的质量控制可为深入开发利用红芪资源提供科学依据。

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（收稿日期：2016-10-20）

（修回日期：2016-11-05；编辑：陈静）