昆虫抗真菌肽的作用机制与应用研究进展

张丹丹，刘 磊，唐 艳，裴志花，孔令聪，刘树明，马红霞

(吉林农业大学，吉林长春 130118)



昆虫抗真菌肽的作用机制与应用研究进展

张丹丹，刘 磊，唐 艳，裴志花，孔令聪，刘树明，马红霞*

(吉林农业大学，吉林长春 130118)

昆虫抗真菌肽作为昆虫防御外来病原菌的第一道防线，是构成昆虫先天免疫系统的重要组成部分，不需要免疫记忆并能直接有效地消灭外来入侵的病原体。随着昆虫抗真菌肽的深入研究，目前已发现昆虫抗真菌肽80多种，其主要是通过破坏真菌细胞壁、改变细胞膜通透性及细胞内ROS的产生发挥抑制和杀灭真菌的作用。抗真菌肽的这种作用机制使其广谱且不易产生耐药性和副作用。在农业、食品及医药等多个领域中，昆虫抗真菌肽作为生物农药、天然的防腐剂及新型的抗真菌物质，尤其是对某些耐药性病原菌的杀灭作用更是引起了人们的关注，有望成为一种新型高效的抗真菌药物。

昆虫抗真菌肽；先天免疫；抗真菌机制；耐药性；抗真菌药物

近年来，真菌感染导致患病并死亡的人数呈逐年上升趋势[1]。在一些发展中国家的真菌感染病例中，由于全身性真菌感染导致患者死亡的病例已接近50%[2]。人们在研究昆虫体内抗菌物质时发现，昆虫体内的抗真菌肽对人类、动物及植物致病性的真菌具有良好的抑制杀灭作用。昆虫抗真菌肽是一种天然的高效的小分子物质，其具有广谱抗真菌、不易产生耐药性、毒副作用小等特点[3]，这使昆虫抗真菌肽在生物农药、天然防腐剂及新型抗真菌药物等多个方面存在开发的潜能。本文主要对昆虫抗真菌肽的来源和分类、作用机制及应用前景进行了综述，为开发新型抗真菌药物提供参考。

1 昆虫抗真菌肽的来源及分类

昆虫是地球上数量最多的动物群体，其种类繁多，形态各异。它们常生活在阴暗潮湿的环境中，在长期的进化过程中，昆虫的自身防御系统逐渐完善，使其接触病原微生物而自身不被感染。近年来，由于昆虫体内独特的免疫防御机制，人们逐渐从昆虫体内发现可以抵抗真菌的活性物质。目前人们相继从膜翅目(蜂类，蚁类)、属鳞翅目(蜡螟)、鞘翅目(甲虫)、鳞翅目(蛾类，蝶类)、双翅目(蝇类)、同翅目(蝉，蚜虫)、螳螂目(螳螂)、半翅目(蝽科)、蜚蠊目(地鳖虫)中发现昆虫抗真菌肽80多种(表1)。

根据报道显示，昆虫抗真菌肽的分类方法有很多种，研究学者们按照其结构分为三大类型，即以α螺旋结构为主的抗菌肽、以β折叠结构为主的抗菌肽和不规则结构的抗菌肽。还可以通过分子结构中含有大量特殊氨基酸的抗菌肽分为：富含半胱氨酸类、富含甘氨酸类及富含脯氨酸类[4]。虽然抗真菌肽的结构存在多样性，但他们拥有共同的结构特征[5]，包括分子量小(12个～50个氨基酸残基)、带正电荷(大部分抗菌肽在+2～+9之间)、两亲性的结构[6]。抗真菌肽的这些特性使其能更好的与两性分子结构尤其是带负点的细胞膜作用，对抗真菌肽与微生物膜的相互作用和膜的结合起着至关重要的作用。

表1 已发现的昆虫抗真菌肽

2 昆虫抗真菌肽的作用机制

2.1 破坏真菌细胞壁

真菌细胞壁主要由多糖组成，其除具有固定外形外，还有保护细胞免受各种外界因子(渗透压、病原微生物等)损伤等功能，它是药物作用真菌细胞时的第一道屏障。甘露糖蛋白、β葡聚糖及几丁质是合成细胞壁的主要成分，它们是抗真菌肽识别真菌细胞的靶位置。Gill K等[7]在试验中发现抗真菌肽作用后的克氏念珠菌(Candidakrusei)细胞表面粗糙，出现不规则形状的褶皱，最后细胞壁破裂。试验说明真菌细胞壁在抗真菌肽作用后结构被破坏，细胞壁破裂，最终导致细胞死亡。Wang K等[8]在研究黄蜂毒液中得到的抗真菌肽polybia-MPI对真菌细胞的作用机制时发现，白色念珠菌在抗真菌肽polybia-MPI作用后，电镜下显示真菌细胞形态发生改变，细胞壁形成褶皱和龟裂。同时发现这种小分子多肽可以抑制细胞壁上甘露聚糖和几丁质的合成，从而阻止细胞生物膜的形成，发挥其彻底杀灭真菌的作用。真菌细胞壁与哺乳动物细胞壁的区别在于真菌细胞壁上的甘露糖蛋白，其结构多样化，参与细胞壁的合成和改造，是抗真菌肽准确识别病原菌的靶蛋白。因此，抗真菌肽能够选择性的的识别真菌细胞且发挥作用。

2.2 改变膜通透性

细胞膜是真菌细胞的第二道防线。大多数阳离子抗真菌肽都是通过作用细胞膜产生抑菌作用[9]，例如抗真菌肽papiliocin[10]作用真菌细胞膜使其形成孔隙，破坏细胞膜完整性。这些抗真菌肽作用真菌细胞时，不结合细胞壁上的多糖，而是与细胞膜上带负电荷的磷脂作用，使细胞膜发生去极化反应，钾离子外流，增大细胞膜的通透性，导致细胞内容物外渗而死亡。徐涛田等[11]发现家蝇幼虫抗真菌肽MAF-1作用白假丝酵母菌的细胞膜表面呈现明显的凹陷、皱缩、出现孔洞及内容物渗出致使菌体破裂。Lee W等[12]通过将抗真菌肽Bac2A上4个氨基酸替换改造成Bac8c，对其作用机制进行研究， Bac8c通过与膜电位相互作用，使细胞膜发生去极化；真菌细胞膜上可见穿孔样变，细胞膜的通透性增加，致使细胞内容物流失，最终导致真菌细胞收缩和细胞死亡。抗真菌肽这种膜机制使其快速且广谱的对抗真菌细胞。

2.3 细胞中活性氧的积累

少部分的抗真菌肽不与细胞壁和细胞膜作用，直接穿过细胞膜进入到真菌细胞内，猜测其在细胞内也有作用的靶位。Alberto Muoz A等[13]研究发现，抗真菌肽PAF26最初位于真菌细胞壁或细胞质膜上，随后在细胞内泡状的细胞器中检测到PAF26的积累，随着时间增加泡状的细胞器逐渐增大，最后破裂，导致细胞死亡。随后，被证实在细胞器中产生的是活性氧( reactive oxygen species,ROS)。现已经有研究显示ROS的积累与抑制白色念珠菌的活性有关。histatin-5[14]和scolopendin 1[15]都是对白色念珠菌有很强杀灭作用的抗真菌肽，这两种抗真菌肽通过进入到真菌细胞内，引起线粒体功能障碍，诱导ROS的产生杀灭真菌。Maurya I K等[16]在对抗真菌肽VS3的抗真菌机制的研究中发现VS3小分子肽能作用于白色念珠菌细胞壁使其皱缩，但是在试验中还发现细胞内VS3的量随时间增加逐渐增多，说明VS3进入到细胞内一定有某些靶向结合发挥作用。之后对细胞内ROS的水平进行检测，发现白色念珠菌细胞中活性氧逐渐增多。电镜下观察真菌细胞表面皱缩、破裂，最终导致细胞死亡。由此看来，ROS的积累是某些抗真菌肽杀灭真菌的主要作用机制。

3 昆虫抗真菌肽的应用前景

3.1 在农业和食品上的应用

在农业生产中，农作物富含碳水化合物、能量等为生命体提供营养[17]，正因为如此，它也是微生物生长的良好栖息地。真菌是引起农作物发霉腐烂的主要病原菌，它可以侵染农作物的种子使农作物产量减低也影响农作物的品质，也对农作物的储存带来了很大的难题[18]。Park H G等[19]从蜜蜂体内得到的一个大小为6.6 ku的小分子肽AcICK，通过试验发现AcICK对引起田间禾本科作物发生病害的禾谷镰刀菌有很强的抑制和杀灭作用。并测得禾谷镰刀菌的IC50值为8.96 μmol/L±0.56 μmol/L。潘凌子等[20]利用蜂毒肽对19种农作物病原菌的抑菌活性进行研究，研究显示蜂毒肽对细菌性农作物病原菌及真菌性的作物病原菌有明显的抑制杀灭的作用。尤其是对白菜软腐病菌仅以很小的浓度μg级就能发挥作用。通过蜂毒肽喷洒农作物和浸种试验发现，蜂毒肽对其生长发育及种子萌发均无毒害作用。

在食品原料加工过程中，化学防腐剂一直用来控制细菌的生长和繁殖，然而由于防腐剂的大量使用，使食品安全问题变得日益严重。抗菌肽作为天然的防腐剂具有热稳定性，对细菌和真菌均有很强的抑制作用。Zhao X等[21]从蜂蜜中分离得到抗真菌肽iturin A，对引起食品腐败的常见真菌腐霉菌、青霉菌等有较强的抗真菌活性。党向利等[22]从混合细菌液诱导的家蝇蛹中分离纯化出4种具有抗菌活性的物质，对多种微生物具有不同程度的抗菌作用，且抗菌效果好于天然肽类防腐剂和一些化学防腐保鲜剂。4种抗菌物质中包括3个抗菌肽。目前，尼生素是唯一一个被批准应用于食品防腐的抗菌肽并已在多个国家和地区应用[23]。由此可见，昆虫抗真菌肽将有助与农业生产上真菌感染的防治和食品防腐剂的安全使用。

3.2 在医药领域的应用

临床上常见的抗真菌的药物有氟康唑、两性霉素B等，这种药物不仅具有很大的毒性和副作用，同时，因为在临床上大量的应用，导致很多病原菌产生了耐药性[24]。因此，研发一种广谱、高效、低毒的抗真菌药物迫在眉睫。昆虫抗真菌肽正符合这些要求。它可以选择性的作用真菌细胞，利用其独特的作用机制使不易产生耐药性。罗振华等[25]在研究家蝇抗真菌肽MAF-1对白色念珠菌致病性的影响时发现，MAF-1作用白色念珠菌后，通过抑制芽生孢子的产生，影响了白色念珠菌的繁殖生长，减少了白色念珠菌酵母相细胞对人口腔黏膜上皮细胞的黏附数，从而影响白色念珠菌的致病能力。抗真菌肽ABP-dHC-cecropin A[26]不仅对白色念珠菌有很强的抑制作用，对粗糙脉孢菌、镰刀菌及毛霉菌均有很强的作用。Ji S等[27]将改造后的蜂毒肽CAM-W对白色念珠菌、黄曲霉等7种常见致病性真菌进行抑菌试验检测，结果显示，CAM-W展现了较强的抑制真菌的作用。同时通过对不同pH、温度及蛋白酶的检验中也显示了其较强的稳定性。由此看来，抗真菌肽可望作为药物运用于临床真菌感染的治疗。

4 存在的问题与展望

虽然昆虫抗真菌肽具有抗菌谱广，不易产生耐药性等优点，但是抗真菌肽发展成抗真菌药物还有很多问题，比如自然界中的肽存在易降解，生产成本高等缺点。近年来，有关抗真菌肽的分离、表达、纯化及活性分析的研究报道显著增多,但是其不稳定性及其对细胞的毒性仍不能让其作为药物运用于临床上。因此，将昆虫抗真菌肽研制成药物并商品化是一个新的挑战，还需进一步的研究，使其在不同领域得到更好的开发与利用。

随着生物技术的发达，人们已经可以对昆虫抗真菌肽进行改造，提高其稳定性，增强抑菌活性，减少细胞毒性。一些抗菌肽已经运用于临床治疗药物，食品防腐剂和农药。在不久的将来，昆虫抗真菌肽可也可以应用于临床发挥更好的抗真菌作用，也可以成为一种新型的药物给人类健康带来福祉。

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Progress on Mechanism and Application of Antifungal Peptides from Insects

ZHANG Dan-dan,LIU Lei,TANG Yan,PEI Zhi-hua,KONG Ling-cong, LIU Shu-ming,MA Hong-xia

(JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin,130118,China)

Antimicrobial peptides from insects, as the first line of defense,are the important part of innate immune system in insects.They can directly defense invasive pathogens effectively,and do not need to immune memory.With the further research of insect antimicrobial peptides,more than 80 kinds of insect antifungal peptides have been discovered,which inhibit and kill the fungi through damage fungal cell wall,cell membrane permeability and the generation of ROS in cells.Because of the antifungal mechanism,they are broad-spectrum and not easy to produce drug resistance and side effects.In agriculture,food,medicine and other fields,insect antifungal peptides cause the attention of people as biological pesticides,natural preservatives and new antifungal substances, especially the effect of killing some resistant fungi.It is expected to become a new and effective antifungal drugs.

antifungal peptide from insect; innate immunity; antifungal mechanism; drug resistance; antifungal drug

2016-11-25

国家自然科学基金项目(31572574，31502121);吉林省科技攻关项目(20160204002NY)

张丹丹(1990-)，女，吉林辽源人，硕士研究生，主要从事家蝇抗菌肽研究。*通讯作者

S816.73

A

1007-5038(2017)07-0074-04