豆粕有机质发酵液发酵条件的优化

段雅婕++陈晶晶++庞振才++胡玉林++李伟明++胡会刚

摘 要 对豆粕有机质发酵液的发酵条件进行优化，为香蕉枯萎病提供稳定、有效的生物学防治方法。研究采用单因素试验考察不同因素对豆粕有机质发酵的影响，运用正交试验对实验条件进行优化，结果发现，豆粕有机质最佳发酵工艺为豆粕有机质混悬液稀释5倍，红糖浓度为2.0 g/100 mL发酵15 d。为豆粕发酵液进行规模化生产提供了数据支持。

关键词 豆粕有机质 ；发酵液 ；发酵条件 ；优化

中图分类号 S188 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.07.019

Optimization of Fermentation Conditions for Soybean Meal Fermented Liquid

DUAN Yajie CHEN Jingjing PANG Zhencai HU Yulin LI Weiming HU Huigang

（South Subtropical Crops Research Institute， CATAS / Ministry of Agriculture Key

Laboratory for Biology of Tropical Fruit Trees， Zhanjiang， Guangdong 524091）

Abstract The fermentation conditions for producing soybean meal fermented liquid was optimized and used to control banana fusarium wilt. Single factor experiment was designed to determine the effect of different factors on the soybean meal fermentation， based on which orthogonal experiments were arranged to optimize the experimental conditions. Some factors that had higher influence on the fermentation of soybean meal organic matter were selected. The orthogonal experiment showed that soybean meal suspension was diluted at a ratio of 1：5 with the brown sugar concentration of 2.0 g/100 ml and fermented for 15 days to produce better soybean meal fermented liquid. This provided data support for commercial production of soybean meal fermented liquid.

Keywords Soybean meal organic matter ； fermented liquid ； fermentation conditions ； optimization

香蕉枯萎病是香蕉生產上一种毁灭性病害，严重威胁着香蕉的正常生长。据检测发现，目前香蕉枯萎病危害最为严重的是4号生理小种，其寄主的香蕉栽培品种范围很广，危害面积最大，是一种香蕉枯萎病的强致病菌，这种菌经过鉴定为真菌，毒性很强，对香蕉栽培生产造成的危险性和毁灭性最大[1-2]。目前，香蕉枯萎病的防治主要采用化学防治和轮作等农业防治措施，而上述防治方法均存在较多的问题[3-4]。经多项实验及田间使用证明，防治土传性病害较有效的方法是改善土壤微生物的群体作用[5]，而使用豆粕有机质发酵液有利于土壤微生物多样性的恢复，可有效控制香蕉枯萎病的发病率，而且不会产生农药残留，不会产生抗药性[6]。通过对豆粕有机质发酵液中微生物的分析，发现其中含有多种对香蕉枯萎病病菌具有拮抗作用的菌株，也是豆粕有机质发酵液防治香蕉枯萎病的主要原因[7]。不同的发酵方法和发酵对微生物的种类、数量产生决定性的影响[8-9]。在使用豆粕有机质防治香蕉枯萎病的过程中，蕉农一般采用传统的自然发酵方法使豆粕有机质发酵，然后直接施用到蕉园中。由于发酵方法粗放，发酵过程中各种条件缺乏科学的管理和控制，施用到蕉园后，对香蕉枯萎病的防治效果差异巨大，难以达到稳定控制香蕉枯萎病发病的效果。本研究通过对豆粕有机质发酵液的发酵条件进行优化，以期摸索出生产豆粕有机质发酵液的最佳发酵条件，为香蕉枯萎病提供稳定、有效的生物学防治方法。

1 材料和方法

1.1 材料

豆粕有机质：南亚热带作物研究所，本实验室保存。

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，自来水1 000 mL。

菌株：香蕉枯萎病菌（Fusariumoxysporumf.sp.cubense Snyder & Hansen，简称为Foc）为尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种，中国热带农业科学院海口实验站/香蕉研究所，曾会才课题组提供。

仪器：振荡器、摇床、三角瓶、涂玻棒、无菌操作台、酒精灯、离心管、离心机、PCR仪等。

1.2 方法

1.2.1 影响因素的筛选

豆粕有机质磨碎，加水配制成1 g/mL的混悬液，按照不同的发酵方法分别进行发酵，发酵之后，取发酵液稀释至10倍，备用。取Foc4菌丝块（以下称“靶标菌株”）接入PDA培养基平板中间，所得的豆粕发酵液接种在距靶标菌株菌丝块2～3 cm处的四周，28℃培养1～2 d，每个处理设置3次重复，计算抑菌带宽度的平均值。

抑制率%=（对照菌直径-处理菌直径）/（对照菌直径-菌饼直径）。

数据采用和统计软件进行方差分析及多重比较。

1.2.2 豆粕有机质浓度的选择

豆粕有机质分别稀释至2、4、5、8、10、15倍，按照1.2.1的方法进行发酵，并测定不同稀释浓度的豆粕有机质发酵后抑菌带的宽度。比较豆粕有机质浓度对豆粕有机质发酵液抑菌效果的影响。

1.2.3 发酵基质的选择

在豆粕有机质混悬液分别加入蔗糖、红糖、麸皮、椰糠、玉米粉，按照1.2.1的方法进行发酵，并测定抑菌带宽度。考察不同发酵基质对豆粕有机质发酵液抑菌效果的影响。

1.2.4 发酵基质浓度的选择

根据1.2.1筛选出的基质，分别设定0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/100 mL 6个不同的浓度，按照1.2.1的方法进行发酵，并测定抑菌带宽度。考察不同的基质浓度对发酵液抑菌作用的影响。

1.2.5 发酵时间的选择

根据1.2.1筛选出的基质，按照1.2.1的方法进行发酵，并在第1、3、5、10、15、17 d取发酵液，分别测定其抑菌带宽度。考察发酵时间对发酵液抑菌作用的影响。

1.2.6 发酵条件的优化

根据单因素的实验结果，选择豆粕有机质浓度、发酵基质浓度和发酵时间为考察因素，每个因素设置低、中、高水平进行正交试验，分别测定各豆粕有机质发酵液的抑菌带宽度。各因素水平如表1。

2 结果与分析

2.1 豆粕有机质浓度对发酵液抑菌效果的影响

随着豆粕有机质稀释倍数的增加，豆粕有机质发酵液的抑菌带宽度呈先上升后降低的趋势，稀释5倍的抑菌带宽度达到最大值。不同稀释倍数的豆粕有机质发酵液的抑菌带宽度如图1。

2.2 不同发酵基质对发酵液抑菌效果的影响

通过在豆粕有机质混悬液中添加不同发酵基质，豆粕有机质发酵液的抑菌效果有不同程度的提高，抑菌带宽度均有所增加，其中添加了红糖的豆粕有机质发酵液抑菌效果最好，结果如表2。因此，本实验中选择红糖作为发酵基质。

2.3 发酵基质浓度对发酵液抑菌效果的影响

随着豆粕有机质混悬液中红糖浓度的增加，豆粕有机质发酵液的抑菌效果逐渐增强，并在2.5 g/mL之后趋于稳定。

2.4 发酵天数对发酵液抑菌效果的影响

随着发酵天数的增加，豆粕有机质发酵液的抑菌带宽度呈先上升后下降的趋势，并且在发酵第15 d时达到最大值，结果如图3。

2.5 正交试验对发酵条件的优化

根据单因素的试验结果，选择L9（34）正交表安排试验，具体实验如表3。

通过对正交试验的结果分析可以看出，各因素对豆粕有机质发酵液抑菌效果影响从大到小依次为：C>B>A，最佳发酵工艺组合为A2B2C2，即豆粕有机质混悬液稀释5倍，红糖浓度为2.0 g/100 mL发酵15 d。

3 讨论

生物防治是目前公认比较安全和有效的防控香蕉枯萎病的措施之一，并符合环保和有机食品要求[10]。有机质饼肥发酵而成的液体肥料能较好的抑制多种病原菌，降低作物的发病率[11]。抑制土传病害需要依赖土壤微生物群体作用，土壤微生物群落结构越丰富、物种越均匀、多样性越高时，抑制病原菌能力越强。豆粕有机质发酵液中微生物，尤其是其中的拮抗菌，是防治香蕉枯萎病的重要因素。而发酵条件对发酵产物中微生物的种类和数量起着决定性作用。本研究通过单因素对影响微生物的多项因素进行筛选，并通过正交试验对豆粕有机质发酵条件进行优化，通过比较不同处理对香蕉枯萎病病菌的抑制作用，得到了豆粕有机质发酵的最优条件，即豆粕有机质混悬液稀释5倍，红糖浓度为2.0 g/100 mL发酵15 d。采用上述条件，发酵所得的豆粕有机质发酵液具有较好的抑菌效果。为豆粕发酵液进行规模化生產提供了数据支持，也为豆粕发酵液大范围应用于香蕉枯萎病的防治提供理论依据。

由于土壤微生物是个非常复杂的系统，仅仅依赖该方法难以充分认识土壤微生物的多样性和复杂性，需要结合分子生物学及其他方法，如可结合基因芯片、稳定同位素探针等技术更深入、全面了解土壤微生物信息。本实验目前只对发酵液进行了平板抑菌实验。因此，进行盆栽苗和大田香蕉植株的防治实验，进一步优化豆粕有机质发酵液的发酵条件，以期形成相对成熟的豆粕有机质发酵方法，从不同角度深入认识土壤微生物多样性变化，阐述其与香蕉枯萎病害发病程度的相互关系，为生态控制土传病害提供技术支撑，以更好地发挥生物防治对香蕉枯萎病的防治效果，探索香蕉枯萎病生物防治的新途径。

参考文献

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