桑葚粗提液对壬基酚诱导大鼠焦虑行为的干预作用及其机制

刘 焕,杨 婕,黄少文,刘瑞菁,贺永健,柳春红(华南农业大学食品学院,广东省食品质量安全重点实验室,广东广州 510642)



桑葚粗提液对壬基酚诱导大鼠焦虑行为的干预作用及其机制

刘 焕,杨 婕,黄少文,刘瑞菁,贺永健,柳春红*
(华南农业大学食品学院,广东省食品质量安全重点实验室,广东广州 510642)

目的:探讨桑葚粗提液对壬基酚染毒大鼠焦虑行为的干预效果。方法:48只SPF级SD大鼠随机分为正常对照组(玉米油)、桑葚对照组(桑葚粗提液,按多酚含量计,120 mg/kg)、壬基酚染毒组(270 mg/kg)、桑葚粗提液低、中、高剂量干预组(壬基酚灌胃剂量均为270 mg/kg,桑葚粗提液干预剂量分别为30、60和120 mg/kg),利用旷场实验(OFT)和高架十字迷宫(EPM)来观察桑葚粗提液对壬基酚染毒大鼠焦虑行为的影响,并用ELISA试剂盒检测单胺类神经递质5-羟色胺、多巴胺、去甲肾上腺素水平和单胺氧化酶活性。结果表明,高剂量干预组大鼠在旷场实验中进入中央区域距离、进入中央区域的次数以及在高架十字迷宫实验中进入开臂时间百分比和进入开臂次数百分比均显著高于染毒组(p<0.05)。与壬基酚染毒组相比,高剂量干预组大鼠下丘脑5-羟色胺和多巴胺水平,中剂量干预组大鼠下丘脑多巴胺水平显著下调(p<0.05),而且高剂量干预组还明显上调单胺氧化酶的活性(p<0.05)。同时随着干预剂量的增加,去甲肾上腺素水平逐渐降低但并无显著性差异。结论:桑葚粗提液降低壬基酚所致焦虑大鼠下丘脑5-羟色胺、多巴胺、去甲肾上腺素水平,其作用机制可能与上调下丘脑单胺氧化酶的活性有关。

壬基酚,桑葚提取液,单胺类神经递质,旷场实验,高架十字迷宫

壬基酚聚氧乙烯醚硫酸钠(Nonylphenol Ethoxylates,NPEs)被广泛用于生产非离子表明活性剂、洗涤剂、橡胶、绝缘材料等,在日用品、医药、农药、化妆品、玩具等数十个行业中均有存在[1]。壬基酚(Nonylphenol)是合成NPEs的单体,是酚类环境雌激素之一,广泛存在于环境中[2]。目前关于壬基酚对环境污染的研究主要集中于水体污染方面[3-6];关于壬基酚毒性的研究则基本集中于生殖毒性和免疫毒性方面[7-9],同时有研究表明环境雌激素(壬基酚,邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯)通过影响神经递质间接导致焦虑[10-11]。目前针对外源化学物的毒性干预研究报道不多,对壬基酚神经行为毒性的干预更是鲜有报道。

桑葚,又称桑果、桑枣,被卫生部列为“既是食品又是药品”的产品之一,具有较高的营养价值[12-13]。到目前为止,从桑葚中已分离出150多种化合物,其中活性物质主要为多酚和活性多糖[14]。研究认为,桑葚具有防癌、抗氧化、抗衰老、降血糖、提高免疫力、改善大脑功能等功效[15-17]。同时有研究表明桑葚可影响大鼠的焦虑行为[18-19]。鉴于焦虑在现代生活中普遍发生,本研究以食品或环境污染物壬基酚为染毒物质,以桑葚提取液进行干预,通过旷场实验和高架十字迷宫两类神经行为学评价方法,从单胺神经递质的角度来分析桑葚提取液对壬基酚染毒大鼠的神经调节作用,以期为人类焦虑预防提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜成熟桑葚 国家桑树种植资源华南分圃;壬基酚 纯度>99.9%,美国Sigma公司;大鼠5-羟色胺(5-HT)ELISA试剂盒、大鼠去甲肾上腺素(NE)ELISA试剂盒、大鼠多巴胺(DA)ELISA试剂盒、大鼠单胺氧化酶(MAO)ELISA试剂盒 上海江莱生物科技有限公司;雄性SPF级Sprague-Dawley(SD)大鼠 48只,4～5周,体重70～90 g,动物及饲料均购自广东省医学实验动物中心,实验动物合格证号:SCXK(粤)2013-0002,华南农业大学实验动物中心许可证号:SYXK(粤)2014-0136。

旷场实验箱(OFT)、高架十字迷宫(EPM) 上海移数信息科技有限公司;Multiskan Mk3型多功能酶标仪 美国Thermo Fisher公司;Ethovision 8.0型行为轨迹跟踪分析系统 荷兰Noldus公司;大鼠饲养笼 苏杭科技器材有限公司;Lab-1B-80真空冷冻干燥机 北京博医康有限公司;ultraLC 110-XL HPLC AB SCIEX Triple TOF 5600超高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪 美国SCIEX公司。

1.2 桑葚粗提液制备

参考胡金奎的方法[20],略有改动。新鲜桑葚冷冻干燥后粉碎过60目筛,样品-20 ℃储存备用;准确称取一定量的桑葚粉末,浸入一定量乙醇(体积分数80%、料液比为1∶15),超声辅助提取90 min,桑葚果渣重复超声提取,得到的总提取液在3000 r/min的条件下离心10 min,随之进行真空抽滤,滤液于45 ℃减压旋蒸除去乙醇并浓缩,储存于4 ℃备用。

1.3 多酚含量测定

采用福林-酚法测定桑葚粗提液多酚含量[21]。

标准曲线的建立:准确称取没食子酸标准品50 mg,用乙醇(80%)定容至50 mL,得到没食子酸标准母液(1 mg/mL)。分别将母液稀释成50、100、150、200、250、300、350、400 μg/mL的标准液。分别取125 μL的标准液加入125 μL的福林酚混合静置6 min,加入7% Na2CO3(1.25 mL),用水调至3 mL(加水1.5 mL),放置90 min,760 nm测定吸光度,得到标准曲线。

样品测定:将提取液稀释100倍,取125 μL按上述步骤测定吸光度,以标准曲线回归方程计算桑葚粗提液多酚的含量。

1.4 实验动物分组与处理

大鼠单笼饲养,光/暗周期12 h/12 h(光照时间07:00～19:00),室内温度为(22±0.5) ℃,湿度为50%～60%。大鼠适应性饲养7 d,适应期及干预期内所有大鼠自由摄食和饮水。适应期后按体重采用随机区组设计分组法分为6组:正常对照组、壬基酚染毒组、桑葚对照组、桑葚粗提液低、中、高剂量干预组,每组8只。正常对照组:玉米油;壬基酚染毒组:壬基酚270 mg/kg;桑葚对照组:以多酚含量计,120 mg/kg;3个干预组为壬基酚270 mg/kg+桑葚粗提液30、60或120 mg/kg。每天上午9:00干预组与染毒组灌胃壬基酚(溶于玉米油),正常对照组和桑葚对照组灌胃等体积(2 mL)玉米油;1 h后,桑葚对照组和干预组灌胃桑葚粗提液(溶于生理盐水),对照组与染毒组灌胃等体积(2 mL)生理盐水,连续灌胃28 d。

1.5 行为学测试

行为实验前,彻底清洁OFT和EPM装置,设置好相关程序,保证实验室通风良好。干预前后均提前1 h将所有大鼠转移至行为学实验室,以适应环境。实验开始时,从笼内轻轻取出大鼠(背对实验者),将大鼠放入OFT和EPM装置,实验者立即离开,通过动物行为轨迹跟踪系统采集大鼠5 min内在OFT和EPM中的活动信息。实验结束后用75%的酒精彻底清洁装置,并用纸巾擦干。行为学评价指标包括:旷场实验:总距离、中央区运动距离、进入中央区时间、进入中央区次数、直立次数和修饰次数;高架十字迷宫:进入开臂时间百分比、进入开臂次数百分比和入臂总次数。

1.6 下丘脑单胺类神经递质与MAO的测定

行为学实验结束后,各组大鼠断颈处死,解剖出下丘脑,并称重,用预冷的PBS溶液冲洗下丘脑表面的血迹,滤纸吸干,制成10%下丘脑匀浆,在2000 r/min、4 ℃下离心20 min,取上清液,用相应的ELISA试剂盒分别测定其5-HT、NE、DA及MAO的水平。

1.7 统计学处理方法

表1 干预前各组大鼠OFT行为比较Table 1 Comparison of open field test behavior of rats after the experimental intervention

表2 干预后各组大鼠OFT行为比较Table 2 Comparison of open field test behavior of rats after the experimental intervention

注:与正常对照组相比,*p<0.05,**p<0.01;与壬基酚染毒组相比,#p<0.05,##p<0.01;表3、表4、图2～图5同。

所有数据以Mean±SD表示,n=8。采用SPSS 19.0软件进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),进一步进行组间两两比较,若方差齐时,采用LSD检验;若方差不齐,则采用Tamhane’s检验,p<0.05认为差异显著,p<0.01差异极显著。

2 结果与分析

2.1 桑葚粗提液多酚含量

没食子酸标准曲线y=0.0034x-0.0298,R2=0.9984,得到桑葚粗提液多酚的含量为(34.86±0.09) mg/mL。

2.2 行为学实验结果

2.2.1 OFT结果 由OFT是利用动物对新异环境的恐惧和探究的矛盾心理特性来考察动物的焦虑状态[22]。动物的焦虑程度越高,越倾向于在周边区域活动[23]。大鼠在中央区域运动的距离越长,进入中央区域的时间越长,进入中央区域的次数越多,就说明大鼠的焦虑程度越低。表1可知,各组大鼠旷场行为学结果在干预前均无显著性差异(p>0.05)。

由表2可知,与正常对照组相比,桑葚对照组大鼠各指标变化不大,无显著性差异,为后文干预组与对照组和染毒组比较提供前提条件。与正常对照组相比,染毒组大鼠中央区域运动的距离、进入中央区域的时间和进入中央区域的次数均极显著降低(p<0.01),说明造模成功,壬基酚能使大鼠产生一定的焦虑。与染毒组相比,高剂量桑葚提取液干预组大鼠中央区域运动距离和进入中央区域的次数显著增加(p<0.05),说明桑葚粗提液具有一定的改善大鼠焦虑的效果,起到了一定的干预效果。同时随着干预剂量的增加,大鼠进入中央区域的距离、进入中央区域的时间和进入中央区域的次数均逐渐增加。

2.2.2 EPM结果 EPM是利用动物对新异环境的探究和对高悬开臂的恐惧形成的矛盾心理来考察动物的焦虑状态[24]。大鼠进入开臂时间百分比和进入开臂次数百分比越高,说明大鼠焦虑程度越低,反之亦然。由表3可知,各组大鼠EMP学结果在干预前均无显著性差异(p>0.05)。

表3 干预前各组大鼠EPM行为比较Table 3 Comparison of elevated plus-maze behavior of rats before the experimental intervention

由表4可知,与正常对照组相比,桑葚对照组大鼠各指标变化不大,无显著性差异,为后文干预组与对照组和染毒组比较提供前提条件。与对照组相比,染毒组大鼠进入开臂时间百分比和进入开臂次数百分比极显著降低(p<0.01),说明造模成功,壬基酚能使大鼠产生一定的焦虑。与染毒组相比,高剂量桑葚粗提液干预组大鼠进入开臂时间百分比显著降低(p<0.05),进入开臂次数百分比极显著增加(p<0.01),中剂量桑葚粗提液干预组大鼠进入开臂次数百分比显著增加(p<0.05),说明桑葚粗提液具有一定的改善焦虑的效果,起到了一定的干预效果。同时随着干预剂量的增加,大鼠进入开臂时间百分比和进入开臂次数百分比均逐渐增加。

表4 干预后各组大鼠EPM行为比较Table 4 Comparison of open-field test behavior of rats after the experimental intervention

注:与正常对照组相比,*p<0.05,**p<0.01;与壬基酚染毒组相比,#p<0.05,##p<0.01。

综上所述,干预后,壬基酚染毒组大鼠进入中央区域距离、进入中央区域的时间及进入中央区域次数极显著低于正常对照组(p<0.01),壬基酚染毒组大鼠进入开臂时间百分比和进入开臂次数百分比也极显著低于正常对照组(p<0.01),两种行为学测试都一致表明:壬基酚暴露诱导大鼠产生焦虑行为。由于壬基酚、双酚A等环境内分泌干扰物与17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)的化学结构相似,能与雌激素受体结合,在机体内模拟E2发挥作用[25]。由此可推断,壬基酚可能与双酚A一样发挥拟雌激素样相应,影响E2与雌激素受体的结合,从而使大鼠产生焦虑的状况。同时Yadav等[18]发现桑葚乙醇提取物可以显著增加大鼠在高架十字迷宫实验中进入开臂的次数和时间,而且还显著增加大鼠在旷场实验中穿越格子数,起到了一定的抗焦虑作用,与本研究结果一致。

2.3 桑葚粗提液对壬基酚染毒大鼠下丘脑神经递质及酶的影响

2.3.1 桑葚粗提液对壬基酚染毒大鼠下丘脑5-HT的影响 由图1可知,与正常对照组相比,桑葚对照组大鼠下丘脑5-HT含量无显著性变化,而染毒组大鼠下丘脑5-HT含量极显著升高(p<0.01),说明壬基酚对下丘脑造成了一定的损伤。与染毒组相比,桑葚提取物处理组大鼠下丘脑5-HT含量呈下降趋势,其中高剂量处理组大鼠下丘脑5-HT含量显著降低(p<0.05),说明桑葚粗提液能够一定程度地缓解这种损伤,起到了一定的干预作用。

图1 各组大鼠下丘脑5-HT水平的变化Fig.1 Changes in the hypothalamic of rats 5-HT levels

2.3.2 桑葚粗提液对壬基酚染毒大鼠下丘脑NE含量的影响 由图2可知,与正常对照组相比,桑葚对照组大鼠下丘脑NE含量无显著性变化,而染毒组大鼠下丘脑NE含量极显著升高(p<0.01),说明壬基酚对下丘脑造成了一定的损伤。与染毒组相比,桑葚提取液处理组大鼠下丘脑NE含量呈下降趋势,但差异不显著,说明桑葚粗提液对大鼠下丘脑NE的作用并不是很明显。

图2 各组大鼠下丘脑NE水平的变化Fig.2 Changes in the hypothalamic of rats NE levels

2.3.3 桑葚粗提液对壬基酚染毒大鼠下丘脑DA含量的影响 由图3可知,与正常对照组相比,桑葚对照组大鼠下丘脑DA含量无显著性变化,而染毒组大鼠下丘脑DA含量显著升高(p<0.01),说明壬基酚对下丘脑造成了一定的损伤。与染毒组相比,桑葚提取液处理组大鼠下丘脑DA含量呈下降趋势,其中中剂量和高剂量处理组大鼠下丘脑DA含量显著降低(p<0.05),说明桑葚粗提液能够一定程度的改善这种损伤作用,起到了一定的干预作用。

图3 各组大鼠下丘脑多巴胺水平的变化Fig.3 Changes in the hypothalamic of rats dopamine levels

2.3.4 桑葚粗提液对壬基酚染毒大鼠下丘脑MAO活力的影响 如图4可知,与正常对照组相比,桑葚对照组大鼠下丘脑MAO活力无显著性变化,而染毒组大鼠下丘脑MAO活力极显著降低(p<0.01),说明壬基酚对下丘脑造成了一定的损伤。与染毒组相比,仅桑葚提取液高剂量处理组大鼠下丘脑MAO活力极显著升高(p<0.01),说明桑葚粗提液能够一定程度的改善这种损伤作用,起到了一定的干预作用。

图4 各组大鼠下丘脑MAO水平的变化Fig.4 Changes in the hypothalamic of rats MAO levels

桑葚具有良好的保健作用,本实验中桑葚粗提液的主要活性物质是多酚类物质。本实验结果表明，桑葚粗提液可以通过增加MAO活性来降低神经递质的含量,起到一定的抗焦作用。Xu等研究[26]发现反白藜芦醇能上调大鼠脑内的5-HT、NE和DA的水平,降低MAO的活性,起到了白藜芦醇相反的效果从侧面说明白藜芦醇的抗焦虑作用;刘露[27]研究发现芦丁可以上调染毒三甲基氯化锡大鼠脑内的5-HT、NE和DA的水平,这可能是因为三甲基氯化锡毒性作用使5-HT、NE和DA的水平过低,芦丁一定的解毒作用,使神经递质水平维持平衡;刘倩佟等[28]发现槲皮素能下调大鼠脑内5-HT和DA的水平;同时本研究质谱分析显示桑葚粗提液有花色苷(矢车菊-3-葡萄糖苷)、芦丁、槲皮素、白藜芦醇等[29],由此推测可能是这类物质起到的干预作用。

3 结论

现代医学认为5-HT、NE、DA等神经递质水平的增加,是引起焦虑病的原因之一[30-32]。研究表明,雌激素能抑制大鼠脑中MAO酶活性[33],而本实验结果显示,壬基酚染毒后的大鼠下丘脑内5-HT、NE、DA的含量极显著升高(p<0.01),焦虑大鼠亦出现MAO活性极显著降低(p<0.01)。由此推测壬基酚是通过降低MAO酶的活性从而阻断单胺类神经递质的正常分解,使得脑内单胺类神经递质的水平升高而导致焦虑。同时桑葚粗提液干预组大鼠下丘脑中5-HT、NE、DA水平明显降低,MAO水平明显升高,提示桑葚粗提液特别是高剂量桑葚粗提液可以有效干预壬基酚染毒所引起的焦虑。本研究为桑葚的深加工提供了一定的借鉴,同时也为壬基酚毒性干预研究提供了思路。

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Intervention effects and mechanism research of mulberry crude extract on nonylphenol anxiety behavior of SD rats induced by nonylphenol

LIU Huan,YANG Jie,HUANG Shao-wen,LIU Rui-jing,HE Yong-jian,LIU Chun-hong*

(College of Food Science,South China Agricultural University,Key Laboratory of Food Quality and Safety in Guangdong Province,Guangzhou 510642,China)

The aim of this study was toinvestigate the interventioneffects of mulberry crude extract(MCE)on anxiety behaviors of SD rats exposed to nonylphenol(NP). 48 SPF rats were randomly divided into 6 goups:normal control group(corn oil),MCE control group(120 mg/kg),NP model group(270 mg/kg),and three intervention groups(120 mg/kg NP+30 mg/kg MCE,120 mg/kg NP+60 mg/kg MCE,120 mg/kg NP+120 mg/kg MCE). The open field test(OFT)and elevated plus maze(EPM)were used to evaluate anxiety behaviors of the rats while the ELISA kitswere used to detect the levels of monoamine neurotransmitter,including serotonin,dopamine,norepinephrine and monoamine oxidase. The distance traveled in the center and entrance frequency to the center of the high-dose intervention groupwere significantly higher thanthe NP group in the OFT. The percentage of open arm entries and time of the high-dose intervention group rats were significantly higher thanthe NP group in the EPM test(p<0.05). Compared with the nonylphenol group,the hypothalamic serotoninand dopamin levels in the high-dose intervention group were significantly lower(p<0.05),the hypothalamus dopamin level was significantly lower in the middle-dose intervention group(p<0.05)and MAO activity of high dose intervention group was significantly increased(p<0.05). Meanwhile as intervention dose increased,norepinephrine levels gradually reduce with no significant difference. Mulberry crude extract can reduce the levels of serotonin,dopamine,norepinephrine in hypothalamus of rats with anxiety caused by nonylphenol and the underlying mechanism may involve up-regulation of MAO activity.

nonylphenol;mulberry crude extract;monoamine neurotransmitter;open field text;elevated plus maze

2016-12-20

刘焕(1991-)，男，硕士，研究方向：营养与食品安全，E-mail：liuhuanjzcd@126.com。

*通讯作者:柳春红(1968-)，女，博士，教授，研究方向：营养与食品安全，E-mail：liuch@scau.edu.cn。

广东省自然科学基金项目(2016A030313395)；农业部农产品质量安全监管项目(GJFP201601106)；广东省科技计划项目(2013B020204001)；广东省现代农业产业技术体系创新团队建设项目(2016LM2152)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)14-0294-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.058