诺丽果、种子和叶提取物抑菌活性及复合植物抑菌液配方筛选

刘霭莎,洪启恩,冯兴江,毛祥飞,黄业福,邵远志,易美华,*(.海南诺尼生物工程开发有限公司,海南海口 57000; .海南大学食品学院,海南海口 57000)



诺丽果、种子和叶提取物抑菌活性及复合植物抑菌液配方筛选

刘霭莎1,洪启恩1,冯兴江1,毛祥飞1,黄业福1,邵远志2,易美华2,*
(1.海南诺尼生物工程开发有限公司,海南海口 570100; 2.海南大学食品学院,海南海口 570100)

研究诺丽果、种子和叶提取物的抑菌活性。通过考察诺丽果发酵汁、种子乙醇提取物、种子水蒸馏提取物、诺丽叶提取物、金银花提取物分别对铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、变形链球菌4种致病菌的抑菌活性,筛选出了抑菌活性较强的3种提取物(诺丽果发酵汁、种子水蒸馏提取物、金银花提取物)。通过单因素实验、3因素3水平正交实验,优化了复合植物抑菌液的最佳配方。结果表明:以诺丽发酵汁87%、种子水蒸馏提取物8%、金银花提取物5%制成的抑菌液,抑菌圈直径分别为:铜绿假单胞菌15 mm,大肠埃希菌22 mm,金黄色葡萄球菌28 mm,变形链球菌17 mm。抑菌效果较好。结论:复合植物抑菌液具有抑菌的作用,为进一步开发抑菌产品提供理论依据。

诺丽,提取物,抑菌,致病菌,配方筛选

诺丽(Noni),学名Morindacitrifolia,又称海滨木巴戟、海巴戟天、诺尼,为茜草科巴戟天属灌木至小乔木,诺丽主要生长在南太平洋群岛,在我国主要分布在台湾、海南及西沙群岛。

诺丽果在国外已成为一种常见的食品,特别是波利尼西亚等地区,当地人使用诺丽果已有两千多年的历史。研究表明,诺丽果富含20多种氨基酸、维生素C等多种营养成分[1],还含有多糖[2]、环烯醚萜[3]、蒽醌类[3]等多种有效成分,具有体外抗肿瘤、抗氧化、抑菌消炎等[4]活性;诺丽叶含有黄酮、皂甙、多糖等活性成分[1],种子含有甾醇类、东莨菪亭[5-6]等活性成分。目前,有关诺丽果汁和诺丽叶的提取物显示良好的抑菌活性[7-8],金银花中的绿原酸类成分有明显的抗菌消炎活性等已有文献报道[9],但诺丽种子的提取物抑菌未见报道。本文分别对诺丽果发酵原液、种子、叶、金银花提取物的抑菌活性进行研究,优化较低浓度的复合植物抑菌液配方,为进一步开发植物复合抑菌液提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

诺丽果、叶子 海南诺尼生物工程开发有限公司;金银花、盐酸左氧氟沙星 购自当地药店;大肠埃希菌(Escherichiacoli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、变形链球菌(Streptococcusmutans) 中国工业微生物菌种保藏管理中心;胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)、脑心浸液培养基(BHI) 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

H-1650高速台式离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司;CH-9230旋转蒸发仪 瑞士BUCHI公司;恒温培养箱 上海迅能电热设备有限公司;发酵罐 温州市亿一机械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 各组分提取物的制备 诺丽果发酵汁:取一定量新鲜成熟的诺丽果于发酵罐中,密封室温自然发酵40 d,取汁,过滤,取清液待用。

种子乙醇提取物:分离出诺丽种子,晾干,打碎,过40目筛,称取20 g诺丽种子,按照1∶10 g/mL的料液比加95%乙醇溶液中,浸泡6 h后,抽滤清液,6000 r/min离心、60 ℃浓缩,收集油状物质,待用。

种子水蒸馏提取物:称取20 g诺丽种子,置于挥发油提取装置,按1∶8加水加热至沸腾,回流3 h,收集油状物质,待用。

诺丽叶提取物:称取500 g诺丽叶,烘干粉碎,加50%乙醇溶液40 ℃浸泡提取24 h,两次提取液合并后6000 r/min离心、60 ℃浓缩,待用。

金银花提取物:称取100 g金银花按诺丽叶提取物的提取方法得到提取物。

1.2.2 各提取物的单因素抑菌效果研究 以大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和变形链球菌为供试菌,其中前3种是抑菌实验常用致病菌,用胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)进行培养,而后1种是口腔致龋主要病原菌,用脑心浸液培养基(BHI)进行培养。将供试菌的新鲜培养物1 mL置于培养皿,按照不同的菌种加等量的TSB或者BHI培养基迅速混匀,凝固后用打孔器在培养基中打孔,挑出培养基留下若干约10 mm的圆孔,向孔中加120 μL各提取物样品。以盐酸左氧氟沙星为阳性对照、无菌水为阴性对照。置于37 ℃培养12 h。如样品有抑菌活性,则圆孔外会出现直径大于10 mm的透明抑菌圈,量出抑菌圈的直径记录结果。

将1.2.1得到的5种提取物作为5个因素,每个因素按质量百分比加水稀释,取5个浓度进行抑菌实验,筛选出有抑菌活性的提取物。

1.2.3 提取物的复合配方抑菌研究 在1.2.2单因素实验基础上,选择三种提取物设计3因素3水平正交实验(见表1)研究植物抑菌液的复配配方。

表1 正交实验的因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.4 绿原酸含量检测 按照GB/T 22250-2008的方法检测上述诺丽叶、金银花提取物的绿原酸含量。

1.3 数据处理

得到的结果借助正交设计助手2.0分析实验数据。

2 结果与分析

2.1 5种提取物单因素抑菌研究

将5种提取物分别对4种供试菌进行抑菌实验,结果如表2所示。

由表2可知,诺丽果发酵液、诺丽种子水蒸馏提取物、金银花提取物3种抑菌效果较好,其中诺丽果发酵液的抑菌效果随浓度降低而降低,选择100%、87%、75%进入正交实验。种子水蒸馏提取物的抑菌效果较好,对大肠埃希菌的抑制尤为突出,对铜绿假单胞菌的抑制稍差,但是该提取物得率很低,为了减轻生产成本在有效浓度范围内尽量选择低的浓度,则选择降低浓度8%、5%、2%进入正交实验。金银花提取物对铜绿假单胞菌和大肠埃希菌的抑制较明显,但是对变形链球菌的抑制稍差,选择15%、10%、5%进入正交实验。其余两种提取物需要较高浓度才有微弱的抑菌效果,故不考虑。

表2 5种提取物抑菌结果Table 2 The results of five kinds of extracts antimicrobial

表3 复合配方正交实验结果Table 3 Orthogonal experimental results of composite formula

2.2 复合配方抑菌研究

根据表1的结果,选择诺丽果发酵液、诺丽种子水蒸馏提取物、金银花提取物3种,采用3因素3水平设计正交实验,结果如表3所示。

使用正交分析软件,计算结果见表4，铜绿假单胞菌,各因素主次顺序为A>C>B,较优配方组合为A3B1C3,其中7号实验正是A3B1C3组合,并且可看出是所有实验组中最优配比。大肠埃希菌,各因素主次顺序为C>B>A,较优配方组合为A3B3C1,按A3B3C1进行实验,重复3次取平均值,得出抑菌圈为24 mm,同表3中的8号实验组结果相同,故较优组合为A3B3C1和A3B2C1。金黄色葡萄球菌,各因素主次顺序为A>C>B,较优配方组合为A3B3C1,按A3B3C1进行实验,重复3次取平均值,得出抑菌圈为29 mm,高出表3中任何一组实验,故最优组合为A3B3C1。变形链球菌,各因素主次顺序为B>A>C,较优配方组合为A2B3C1或A2B3C2,其中6号实验正是A2B3C1组合,同时对A2B3C1和A2B3C2进行实验,重复3次取平均值,得出A2B3C1抑菌圈为18 mm,A2B3C2抑菌圈为17 mm,故最优组合为A2B3C1。

综合上述分析,结合产品的开发需求,用于对口腔致龋菌的抑制,优先考虑抑制变形链球菌效果较好的6号实验配方,即诺丽发酵液87%、种子水蒸馏提取物8%、金银花提取物5%,该配方对另外3种致病菌虽然不是最优配方,但是也有较好的抑制效果。

2.3 诺丽叶、金银花的绿原酸含量

诺丽叶的绿原酸含量为24.2 mg/kg,金银花的绿原酸含量为363.8 mg/kg。由此可知金银花的绿原酸含量较高,实验检测结果也与文献[10]报道符合,绿原酸是金银花的主要抗菌、抗病毒有效药理成分,具有广泛的抗菌作用,和本实验的结果相符合。诺丽叶的绿原酸含量较低,这可能是叶子提取物抑菌效果不明显的原因。

表4 正交实验结果分析Table 4 Analysis of orthogonal experimen results

3 结论

本实验采用正交实验设计,结合实际开发需求,主要抑制口腔致龋菌,初步选择效果较好的组分比例为6号配方,即诺尼发酵液87%、种子水蒸馏提取物8%、金银花提取物5%,抑菌圈直径分别为:铜绿假单胞菌15 mm,大肠埃希菌22 mm,金黄色葡萄球菌28 mm,变形链球菌17 mm。

诺丽种子水蒸馏提取物即挥发油,主要是酯类物质,根据吴慧娟[11]等,抑菌作用位点可能位于细菌细胞膜上,破坏细胞膜磷脂双分子层的完整性,引起细胞裂解,达到抑菌效果。

诺丽叶的绿原酸含量较低,目前的提取方法不能得到含量较高的提取物,抑菌效果不理想,今后需要进一步改进提取工艺。

诺丽作抑菌实验已有报道,李金霞[7]等利用诺丽十倍浓缩液能有效抑制食源性致病菌;龚敏[12]等报道诺丽果汁的乙酸乙酯和正丁醇萃取段具有明显的抑菌作用;诺丽提取物凝胶能抑制粪肠球菌生长[13];Zhang[8]等报道诺丽叶的正丁醇等有机溶剂提取物也有很好的抑菌效果。本实验利用诺丽发酵原液而非浓缩液,配合种子和金银花的水提取物组成复合植物配方液,成分安全,抑菌效果较好,相比市面上应用广泛的氯己定类口腔护理产品在牙齿上会留痕迹、不美观,诺丽传统的抗菌消炎作用,为日后开发口腔护理产品打下基础。

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Study on antimicrobial properties of Noni fruit,seed and leaf extract and screening of antimicrobial composite formula

LIU Ai-sha1,HONG Qi-en1,FENG Xing-jiang1,MAO Xiang-fei1, HUANG Ye-fu1,SHAO Yuan-zhi2,YI Mei-hua2,*

(1.Hainan Noni Biological Engineering Development Co.,Ltd.,Haikou 570100,China; 2.College of Science and Technology,Hainan University,Haikou 570100,China)

The paper researched the antimicrobial properties of extracts of Noni fruit,seed and leaf extract. By studying the antimicrobial properties of Noni fruit fermented juice,seed ethanol extract,seed steam distillate extract,Noni leaf extract and honeysuckle extract respectively on four kinds of pathogens as the target,Pseudomonas aeruginosa,Escherichiacoli,Staphylococcusaureus,Streptococcusmutans,three kinds of extracts with stronger antimicrobial properties(Noni fruit fermented juice,seed steam distillate extract and honeysuckle extract)were screened out. Through the experimental results from the single factor experiment and three factors three levels orthogonal experiments,the best formula of compound plant bacteriostatic liquid was optimized. The results showed that the antimicrobial effect of liquid mixed from 87% of the Noni fruit fermented juice,8% of the distilled steam extract and 5% of the honeysuckle extract was the best. The inhibition zone diameters of different bacteria were 15 mm ofPseudomonasaeruginosa,22 mm ofEscherichiacoli,28 mm ofStaphylococcusaureus,17 mm ofStreptococcusmutans. The compound plant bacteriostatic liquid has antimicrobial effect,and it provides theoretical basis for further developing antimicrobial product.

Noni;extract;antimicrobial;pathogens;prescription screening

2016-12-20

刘霭莎(1985-)，女，硕士研究生，研究方向:食品微生物,E-mail:liuaisha2@foxmail.com。

*通讯作者:易美华(1945-)，女，大学本科，教授，研究方向:食品资源开发利用,E-mail:ymh12@163.com。

海南省重点研发计划项目(ZDYF2016175)专项资助。

TS201.1

A

1002-0306(2017)14-0171-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.034