鳕鱼皮明胶-Ca2+复配止血粉的止血活性研究

姚 迪,孙蕾蕾,刘 晗,侯 虎,李八方(中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003)



鳕鱼皮明胶-Ca2+复配止血粉的止血活性研究

姚 迪,孙蕾蕾,刘 晗,侯 虎,李八方*
(中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003)

利用超滤技术制备三个不同分子量段(Mr>50 ku、10 ku

鳕鱼皮明胶,Ca2+,复配止血粉,止血性能

出血是导致创伤患者死亡的主要原因之一[1]。伤口处理过程中,控制出血时间,减少出血量,防止伤口与外界接触感染,有利于患者伤口愈合和后续治疗[2]。传统的止血方法如止血绷带、纱布、海绵等止血材料贴附于伤口,利用机械外力或止血材料的吸水性能阻止伤口出血,但上述止血材料在面对复杂的伤口形状,或者伤口大面积弥漫性出血时效果欠佳。粉状止血产品不受创面大小和部位的影响,使用方便快捷,不仅能快速有效止血,还能形成凝胶有效地保护创面,防止细菌的二次污染,特别适用于复杂的伤口。因此,研究者们努力寻找并开发新型粉状止血材料是目前研究的热点和趋势所在。

鳕鱼皮含有丰富的胶原[3],明胶作为胶原的降解产物,提取简单、提取率高,且具有的无毒[4]、低抗原[5]、生物相容性[6]和生物可降解性[7]等特点备受关注,对其加工利用可以提高水产品的附加值。明胶目前广泛应用于食品、化妆品、医药等加工领域[8]。大量研究结果表明明胶具有优良的止血性能,目前针对明胶止血性能的研究主要集中在医用止血海绵,如明胶壳聚糖止血海绵[9],对不同分子量段明胶基复配止血粉的研究较少。钙离子作为凝血因子之一,参与凝血过程[10]。将明胶与钙离子复配,以发挥材料之间的协同效应。

本研究采用超滤技术得到高分子量(Mr>50 ku)、中分子量(10 ku

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鳕鱼皮明胶 由山东东方海洋科技股份有限公司提供;Wistar大鼠 SPF级,雄性,180～220 g,北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2012-0001;活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(Prothrombin Time,PT)、大鼠 PF4、P-选择素和TXB2试剂盒 南京建成生物工程研究所;氯化钙、乌来糖及其他试剂 均为分析纯。

Alphal-4LD型冷冻干燥机 德国Christ公司;Hitachi835-50型超滤杯、超滤膜 上海摩速科学仪器有限公司;2-16KL型冷冻离心机 Sigma公司;SL-318型半自动凝血仪 济南森蓝科贸有限公司;Power Wave XS2型酶标仪 基因有限公司;RE-52AA型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 不同分子量鳕鱼皮明胶的制备 蒸馏水配制浓度为2%(w/v)的鳕鱼皮明胶溶液,双层滤纸过滤,0.2 MPa 氮气加压下,用截留分子量为10、50 ku 的超滤膜依次超滤处理,得到高分子量(Mr>50 ku)、中分子量(10 ku

1.2.2 不同分子量鳕鱼皮明胶-Ca2+复配止血粉的制备 调节三个分子量段和未分离分子量鳕鱼皮明胶溶液 pH为 5.5,按明胶:氯化钙为9∶1(W/W)添加氯化钙固体试剂,搅拌均匀,混合溶液在50 ℃水浴反应 1 h。反应结束经旋转蒸发浓缩、冷冻干燥、超微粉碎和紫外消毒得到高分子量(Mr>50 ku)、中分子量(10 ku

1.2.3 复合止血粉液体吸收倍率的测定

1.2.3.1 模拟体液(SBF)的配制 精确称取NaCl 8.035 g、NaHCO30.355 g、KCl 0.255 g、K2HPO4·3H2O 0.231 g、MgCl2·6H2O 0.311 g、1 mol/L HCl 39 mL、CaCl20.292 g 和Na2SO40.072 g,按照以上顺序配制成1 L溶液,并用Tris调节pH为7.25,在37 ℃下备用。

1.2.3.2 测定方法 选用生理盐水(NS)、模拟体液(SBF)和枸橼酸盐抗凝全血(WB)三种溶液分别测定四种分子量段的鳕鱼皮明胶-Ca2+复配止血粉的液体吸收倍率。精确称量0.5 g的各组样品,记为Wdry,用滤纸包好,将滤纸包分别同时放入NS、SBF和WB三种溶液中,5 min 后将滤纸包从三种溶液中同时拿出,分别称重,依次记为Wwet-N、Wwet-S和Wwet-W。同等重量的空白滤纸重复上述步骤,记为W滤纸。各组样品在三种溶液中的液体吸收倍率按照公式计算[11]:

1.2.4 体外凝血实验 参考张姝妹等[12]报道方法略有改动。分别准确称取 20 mg 四种分子量段的鳕鱼皮明胶-Ca2+复配止血粉于洁净试管中,在37 ℃恒温水浴锅中预热30 min。采用3.8%枸缘酸钠真空采血管对大鼠腹主动脉取血,每个试管加入0.5 mL的血液。每隔10 s 将试管倾斜约30度观察血液流动情况,当试管中的血液全凝后,停止计时,记下该组的凝血时间。每组测定三个平行,以生理盐水为阴性对照。

1.2.5 大鼠股动脉和肝创面实验 大鼠股动脉和肝创面的止血方法参照张姝妹等[12]报道方法略有改动。选取体重 200 g 左右的健康 Wistar 雄性大鼠 40 只,随机分为5组,每组8只,分别为高分子量、中分子量、低分子量、未分段明胶-Ca2+复配止血粉组和医用纱布组。用30%的乌来糖(氨基甲酸乙酯)进行大鼠腹腔注射麻醉,注射剂量为1 g/kg体重。

1.2.5.1 大鼠股动脉止血实验 大鼠股内侧切一纵向切口,暴露出完整股动脉,使用消毒后的手术剪在大鼠股动脉剪开直径约为0.3 cm的切口。普通纱布擦去涌出的血液后,迅速将200 mg紫外消毒后的复配止血粉均匀撒在切口上,同时开启秒表计时,精确称量的无菌纱布每隔20 s 蘸取渗血,直至无菌纱布无法蘸取到渗血时停止秒表,记为股动脉出血时间。对照组直接用无菌纱布覆盖。出血量为无菌纱布实验前后的重量差[12]。

1.2.5.2 大鼠肝创面止血实验 大鼠剪去腹毛，逐层剥开腹腔，普通纱布快速擦去腹腔与腹壁上的血液和组织液，暴露出大鼠完整肝脏中叶，使用消毒后的手术剪在肝中叶处作长约1 cm，深约0.5 mm的创面，迅速将50 mg紫外消毒后的止血粉撒在切口上,同时计时,精确称量的无菌纱布每隔20 s蘸取渗血,直至无菌纱布无法蘸取到渗血时停止计时。对照组直接用普通纱布覆盖。出血量为无菌纱布实验前后的重量差[12]。

1.2.6 活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT)测定 用生理盐水配制5 mg/mL的高分子量(Mr>50 ku)和中分子量(10 ku

1.2.7 血小板聚集实验 生理盐水配制1 mg/mL的高分子量组(Mr>50 ku)和中分子量组(10 ku

1.2.8 血小板第四因子(PF4)、P-选择素、血栓烷素B2(TXB2)测定 用生理盐水配制1 mg/mL的高分子量组(Mr>50 ku)和中分子量组(10 ku

2 结果与分析

2.1 不同分子量鳕鱼皮明胶-Ca2+复配止血粉的液体吸收性能测定

止血粉的液体吸收倍率是评价止血性能的一项重要指标[12]。止血粉的液体吸收速率越快、吸收量越大,越能在伤口出血时快速吸收血液,使血液中的血小板和凝血因子浓缩,加快止血。同时止血材料吸水膨胀也有助于堵塞伤口,是重要的物理止血途径之一[13]。如图1所示明胶-Ca2+复配止血粉的吸水倍率随着明胶分子量的升高而增大,高分子量组(Mr>50 ku)的液体吸收倍率最大,其次是未分离分子量组,低分子量组(Mr<10 ku)的液体吸收性能最差。

图1 不同分子量明胶-Ca2+复配止血粉的液体吸收性能Fig.1 The absorbance of liquids of different molecular weight gelatin-Ca2+ compound hemostatic powder注:“NS”代表生理盐水,“SBF”代表模拟体液,“WB”代表全血,含有不同字母的每组数据差异显著(p<0.05)。

2.2 不同分子量鳕鱼皮明胶-Ca2+复配止血粉对体外凝血时间的影响

体外凝血时间是评价止血类产品体外凝血性能的一项重要指标。如图2所示,明胶-Ca2+复配止血粉组与生理盐水组相比,体外凝血时间缩短,高分子量明胶-Ca2+复配止血粉的凝血时间最短(p<0.05),平均为(24±8)s,凝血效果最好。未分离分子量组和中分子量组差异不大(p>0.05),原因可能是未分离分子量组的分子量相对集中在10～50 ku之间和中分子量组的分子量分布相似。随着明胶分子量的继续降低,凝血时间延长,明胶-Ca2+复配止血粉的体外凝血效果逐渐减弱。低分子量组的体外凝血时间在100 s以上,与对照组相比,没有显著性差异(p>0.05)。

图2 不同分子量明胶-Ca2+复配止血粉对体外凝血时间的影响Fig.2 Effect of different molecular weight gelatin-Ca2+compound hemostatic powder on coagulation time in vitro注:与生理盐水组相比,*p<0.05,**p<0.01。

2.3 大鼠股动脉和肝创面实验结果

2.3.1 不同分子量鳕鱼皮明胶-Ca2+复配止血粉对大鼠股动脉止血效果的影响 如图3A和B所示,高分子量组明胶-Ca2+复配止血粉的出血时间为(114±36) s,止血时间最短,出血量为(0.71±0.18) g,出血量最少,止血效果最好。研究结果与张姝妹等[12]的大鼠股动脉实验结果相比,出血时间缩短了32 s,原因可能是复合止血粉中引入Ca2+的结果,Ca2+作为凝血因子之一,具有促进凝血的作用。其次是未分离分子量的明胶-Ca2+复配止血粉,出血时间为(145±24) s,出血量为(0.93±0.17) g。随着分子量的降低,股动脉出血时间延长,出血量增加,说明明胶-Ca2+复配止血粉的股动脉止血效果随着明胶分子量的下降而降低。低分子量组与医用纱布对照组相比,没有显著性差异(p>0.05),说明低分子量组对股动脉止血没有明显作用。高分子量的明胶-Ca2+复配止血粉吸水性强,容易使血小板凝聚从而加速止血。

2.3.2 不同分子量鳕鱼皮明胶-Ca2+复配止血粉对大鼠肝创面止血效果的影响 不同分子量鳕鱼皮明胶钙样品的大鼠肝创面出血时间和出血量实验结果如图3A和B所示。高分子量组(Mr>50 ku)明胶-Ca2+复配止血粉的出血时间最短,平均为(97±25) s,出血量最少,平均为(0.42±0.19) g,止血效果最好,随着分子量的下降,肝创面出血时间逐渐延长,出血量逐渐增加,止血效果降低。低分子量组对肝创面止血没有明显作用,这一结果与大鼠股动脉止血实验相符结合。结合上述止血活性实验结果,由于低分子量明胶-Ca2+复配止血粉对大鼠体内、外止血均没有显著作用,故只对中高分子量组做止血机理性研究。

图3 不同分子量明胶-Ca2+复配止血粉对大鼠股动脉和肝创面止血的影响Fig.3 Effect of different molecular weight gelatin-Ca2+ compound hemostatic powder on femoral artery cutting and liver cutting experiments 注:与医用纱布组相比,*p<0.05,**p<0.01。

2.4 不同分子量鳕鱼皮明胶-Ca2+复配止血粉对APTT和PT的影响

图4 不同分子量明胶-Ca2+复配止血粉对APTT和PT的影响Fig.4 Effect of different molecular weight gelatin-Ca2+compound hemostatic powder on APTT and PT注:与生理盐水组相比,*p<0.05,**p<0.01;图5、图6同。

凝血途径主要可以分为内源性凝血途径、外源性凝血途径和凝血共同途径[16]。APTT变化主要表征内源性凝血途径,PT变化主要表征外源性凝血途径[17]。如图4所示,中、高分子量明胶-Ca2+复配止血粉组与生理盐水组相比,APTT时间明显缩短,高分子量明胶-Ca2+复配止血粉组APTT时间最短,而PT 差异不大,这与张姝妹等[11]的研究结果一致,说明明胶-Ca2+复配止血粉主要对内源性凝血途径起作用，通过缩短凝血活酶时间来加速止血。

2.5 不同分子量鳕鱼皮明胶-Ca2+复配止血粉对血小板聚集的影响

在富血小板血浆加入ADP血小板聚集诱导剂可以促进血小板聚集,血小板聚集率随着吸光度值的增加而增大[18]。如图5所示,与生理盐水组相比,中、高分子量明胶-Ca2+复配止血粉组的吸光度值显著增加(p<0.05),说明明胶-Ca2+复配止血粉可以通过促进血小板聚集促进血栓生成加速止血,高分子量明胶-Ca2+复配止血粉组血小板聚集率最高,但显著低于 ADP处理组。

图5 不同分子量明胶-Ca2+复配止血粉对血小板聚集的影响Fig.5 Effect of different molecular weight gelatin-Ca2+compound hemostatic powder on platelet aggregation

2.6 不同分子量鳕鱼皮明胶-Ca2+复配止血粉对PF4、P-选择素和TXB2的影响

图6 不同分子量明胶-Ca2+复配止血粉对血小板释放活性因子的影响Fig.6 Effect of different molecular weight gelatin-Ca2+ compound hemostatic powder on the release of platelet active factors

在止血过程中,血小板被激活后释放一系列活性因子促进血栓形成[19]。血小板第四因子(PF4)是由血小板α颗粒合成的一种特异蛋白质,能够减慢凝血酶灭活过程,促进血栓形成。P-选择素主要介导粒细胞和单核细胞与血小板的黏附。血栓烷 A2(TXA2)是一种血栓素,常用作血管收缩剂,可以促进血小板聚集,TXA2 释放后会很快转变为 TXB2[20]。血浆中血小板释放活性因子含量越高,说明止血效果越好。如图6所示,与生理盐水组相比,高分子量组和中分子量组的明胶-Ca2+复配止血粉处理血浆中血小板释放活性因子 PF4、P-选择素和 TXB2 的含量均有显著增加(p<0.05),其中高分子量明胶-Ca2+复配止血粉组PF4、P-选择素和 TXB2含量最高,说明高分子量明胶-Ca2+复配止血粉通过促进大鼠血小板活性因子的释放来缩短凝血时间。这与血小板聚集实验结果相一致。

3 结论

液体吸收倍率实验中,明胶-Ca2+复配止血粉的吸水倍率随着明胶分子量的升高而增大,高分子量组的明胶-Ca2+复配止血粉的吸水倍率最大。大鼠体外凝血、股动脉出血和肝创面出血的实验结果可以看出,明胶-Ca2+复配止血粉对体、内外止血具有一定的效果。与自然止血组相比,样品组可以明显缩短出血时间,减少出血量。明胶-Ca2+复配止血粉的止血效果与明胶分子量有关,三组实验均可以证明中、高分子量明胶-Ca2+复配止血粉组的止血效果要明显高于低分子量组。通过对中、高分子量明胶-Ca2+复配止血粉止血机理研究发现,明胶-Ca2+复配止血粉可以缩短 APTT 时间,主要作用于内源性凝血途径。高分子量明胶-Ca2+复配止血粉的血小板的聚集效果最明显,且能显著促进血小板活性因子 PF4、P-选择素和 TXB2 的释放来促进止血。这一结果为高分子量明胶-Ca2+复配止血粉作为止血产品的研究提供了依据。

[1]Williams J A,McDonald A H,Strachan G G,et al. Effects of tranexamic acid on death,vascular occlusive events,and blood transfusion in trauma patients with significant haemorrhage(CRASH-2):a randomised,placebo-controlled trial[J]. West Indian Medical Journal,2010,59(6):612-624.

[2]Broderick N. Understanding chronic wound healing[J]. The Nurse Practitioner,2009,34(10):16-22.

[3]Duan R,Zhang J,Du X,et al. Properties of collagen from skin,scale and bone of carp(Cyprinuscarpio)[J]. Food Chemistry,2009,112(3):702-706.

[4]Muhd J N,Akil H M,Ahmad Z. Preparation,properties and applications of chitosan-based biocomposites/blend materials:a review[J]. Composite Interfaces,2011,18(6):449-507.

[5]Amadori S,Torricelli P,Rubini K,et al. Effect of sterilization and crosslinking on gelatin films[J]. Journal of Materials Science:Materials in Medicine,2015,26(2):1-9.

[6]Schortgen F,Lacherade J C,Bruneel F,et al. Effects of hydroxyethylstarch and gelatin on renal function in severe sepsis:a multicentre randomised study[J]. The Lancet,2001,357(9):911-916.

[7]Hattrem M N,Molnes S,Haug I J,et al. Interfacial and rheological properties of gelatin based solid emulsions prepared with acid or alkali pretreated gelatins[J]. Food Hydrocolloids,2015,43(1):700-707.

[8]Cheng S Y,Yuen M C W,Kan C W,et al. Cosmetic textiles with biological benefits:gelatin microcapsules containing vitamin C[J]. International Journal of Molecular Medicine,2009,24(4):411.

[9]Wang X,Yan Y,Zhang R. A comparison of chitosan and collagen sponges as hemostatic dressings[J]. Journal of Bioactive and Compatible Polymers,2006,21(1):39-54.

[10]Logan C V,Szabadkai G,Sharpe J A,et al. Loss-of-function mutations in MICU1 cause a brain and muscle disorder linked to primary alterations in mitochondrial calcium signaling[J]. Nature Genetics,2014,46(2):188-193.

[11]Lan G,Lu B,Wang T,et al. Chitosan/gelatin composite sponge is an absorbable surgical hemostatic agent[J]. Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2015,136(12):1026-1034.

[12]张姝妹,侯虎,李八方. 鳕鱼皮明胶的止血活性和机理研究[J]. 现代食品科技,2016,32(3):18-23.

[13]邓乐君,樊鸿浩,李伟达,等. 可吸收止血材料的生物相容性研究进展[J]. 中国生物医学工程学报,2016,35(2):241-246.

[14]Xu B,Hou S,Cao G,et al. Sustainable nitrogen-doped porous carbon with high surface areas prepared from gelatin for supercapacitors[J]. Journal of Materials Chemistry,2012,22(3):19088-19093.

[15]Fenalti G,Zatsepin N A,Betti C,et al. Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor[J]. Nature Structural & Molecular Biology,2015,22(3):265-268.

[16]Arita Y I,Akutsu K,Yamamoto T,et al. A fever in acute aortic dissection is caused by endogenous mediators that influence the extrinsic coagulation pathway and do not elevate procalcitonin[J]. Internal Medicine,2016,55(12):1845-1852.

[17]Loof T G,Mörgelin M,Johansson L,et al. Coagulation,an ancestral serine protease cascade,exerts a novel function in early immune defense[J]. Blood,2011,118(9):2589-2598.

[18]Eriksson A C,Whiss P A. Measurement of adhesion of human platelets in plasma to protein surfaces in microplates[J]. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods,2005,52(3):356-365.

[19]Andrews R K,Arthur J F,Gardiner E E. Neutrophil extracellular traps(NETs)and the role of platelets in infection[J]. Thromb Haemost,2014,112(4):659-665.

[20]白莉,方伟蓉,孔毅,等. 蛇毒三肽 pENW 的抗血小板黏附作用及其机制研究[J]. 药学学报,2015,50(9):1107-1115.

Hemostatic activity of cod skin gelatin-Ca2+complex hemostatic powder

YAO Di,SUN Lei-lei,LIU Han,HOU Hu,LI Ba-fang*

(College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

Three cod skin-derived gelatin with different molecular weights(Mr>50 ku,10 ku

cod skin gelatin;Ca2+;compound hemostatic powder;hemostatic properties

2016-12-20

姚迪(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：食品加工与功能食品，E-mail:18765939602@163.com。

*通讯作者:李八方(1953-)，男，博士，教授，研究方向：海洋活性物质与功能性食品，E-mail:bfli@ouc.edu.cn。

国家自然科学基金面上项目 (31471606) ；国家自然科学基金青年科学基金项目 (31401476)。

TS254.1

A

1002-0306(2017)14-0035-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.008